Northern印跡和總RNA雜交實驗

甲醛凝膠溶液 RNA 電泳緩沖液

凝膠模 梳齒 凝膠用具

1. 用肥皂和水徹底清洗凝膠模，梳齒和凝膠用具。

2. 準備甲醛凝膠溶液。

甲醛凝膠溶液（300 ml 1％ 瓊脂糖凝膠）：

瓊脂糖，3.0 g

10x RNA 電泳緩沖液，30 ml     

Milli-Q 或用玻璃器皿蒸餾過的水，222 ml

37% 甲醛，48 ml

加熱熔解瓊脂糖。冷卻到 55℃（用溫度計檢査）后加甲醛。在通風櫥中倒膠。

10x RNA 電泳緩沖液（配 500 ml）：

0.2 mol/L MOPS，pH 7.4 1 mol/L MOPS，pH 7.4      100 ml

10 mmol/L EDTA，pH 7.4  0.5 mol/L EDTA，pH 7      10 ml

Milli-Q H₂O                                                                    390 ml

貯存于 4℃，避光。

3. 10 μl 總 RNA 和 30 μl 1.33x RNA 上樣緩沖液混合。



4. RNA 樣品在 65℃ 水浴中加熱 15 分鐘以破壞 RNA 的二級結構。從水浴拿出并立即在冰上放 2 分鐘。

5. 樣品在小離心機上短暫離心（5 秒）使所有液體都流到管底。把樣品放回冰盒。在已準備好的凝膠中上樣。

6. 以 2.5~5 V/cm 凝膠長度進行凝膠電泳，直到溴酚蘭染料的前沿移動到大約 2/3 凝膠長度處。

7. 給凝膠照相。先在紫外燈盒子上鋪一張干凈的塑料膜，然后再把凝膠放到上面。

8. 用毛細轉移或電印跡法把 RNA 轉移到尼龍膜上。

(1) 毛細轉移法

① 用 Milli-Q 或用玻璃器皿蒸餾過的水稍微洗一下凝膠。

② 在準備轉移前，把膜、濾紙和紙巾切成合適的大小。對于毛細轉移法，液體必須在被紙巾堆吸收前通過膜。如果讓紙巾或濾紙接觸凝膠或濾紙條，就會發生“短路”這種情況可以通過依次縮小膜、濾紙和紙巾的大小來避免。

這里給出的尺寸是用于 20 cm x 20 cm 的凝膠。對于不同大小的凝膠要調整尺寸。



③ 在 20x SSC 里打濕濾紙條（26x35 cm 濾紙）并把它鋪在一塊玻璃平板上使兩端垂在盛有 1120X SSC 的平皿中。取一根玻璃吸管用作搟面杖，去掉所有玻璃和濾紙之間的氣泡。

④ 凝膠放在濾紙條上。

⑤ 先在水中然后在 20X SSC 中把膜打濕，接著把膜放到凝膠上。用玻璃吸管去掉所有氣泡。

⑥ 濾紙（18.5 cm x 18.5 cm）在 20x SSC 中打濕，然后放到膜上并確定是放在中間位置。用玻璃吸管去掉氣泡。

⑦ 把紙巾堆放在濾紙上（中間）。

⑧ 紙巾上蓋一個玻璃或塑料盤（如用于倒膠的托盤）并在上面壓重物（例如一個放滿液體的 50 ml 瓶子）。

⑨ 凝膠轉移 8~16 小時。

(2) 電印跡法

① 用 Milli-Q 或用玻璃器皿蒸餾過的水洗凝膠兩次（4 倍凝膠體積，每次洗 15 分鐘），再用 1x TAE 洗一次（4 倍凝膠體積洗 15 分鐘）。

② 按制造商的說明組裝轉移裝置。

③ 在 1x TAE 中以 1 安培的電流轉移 1 小時或在對等的條件下進行轉移（所用的安培數依據供電的限制）

9. 拆掉轉移裝置。用例如 Stratalinker 的紫外交聯儀把 RNA 交聯到濕潤的膜上。

10. 通過對膜照相以確證轉移效率。在 28S 和 18SrRNA 條帶的地方作標記。

11. 在 2x SSC 里洗膜，幾分鐘后，用你的手指（戴干凈的手套）輕輕地擦拭濾膜表面以去除任何黏在上面的瓊脂糖。

12. 用水洗膜，并把膜保存在干凈的紙巾之間，直到準備進行雜交分析。