實驗概要
本文介紹了Northern Blotting實驗詳細操作流程。
實驗材料
1. 試劑盒提供
NorthernMax (Formaldehyde-Based System for Northern Blots)[Catlog#1940]
6ml -20℃ Formaldehyde Load Dye
225ml 4℃ ULTRAhyb
80ml 4℃ 10×Denaturing Gel Buffer
600ml 4℃ 10×MOPS Gel Running Buffer
8g RT Agarose-LE
1000ml RT Transfer Buffer
450ml RT Low Stringency Wash Solution#1
450ml RT High Stringency Wash Solution#2
250ml RT RNaseZap
1ml AT Nuclease-free Water
注：1) RT：室溫；AT：任何溫度
2) 如果試劑中有沉淀出現，屬于正常情況，請于37℃水浴溶解，并搖勻。
3) 一般情況下，試劑盒中的試劑保質期為6個月，如果溫度控制合適，RNaseZap能夠保質一年。
2. 自備
1) 普通用品
a．Nuclease-free water (用于溶解瓊脂糖，稀釋 running buffer到合適的工作濃度)
在雙蒸去離子水中加入DEPC，使終濃度達到0.1%，(例如，1L雙蒸去離子水中加入1mlDEPC)；反復搖晃均勻，于37℃－42℃溫度條件下孵育數小時或過夜也可；高溫高壓滅菌至少45min，這樣DEPC的氣味應該可以完全除去或大部分除去。
b. 聚丙烯小離心管，1.5ml或0.65ml規格。
c. 移液槍，各種規格的槍頭。
d. 一次性手套
e. 雜交膜（例如：Whatman 3MM）
f. 刮胡刀，解剖刀片或剪刀
g. EB（Ethidium bromide）
h. 塑料包裝袋
i. 紙巾
j. 搪瓷托盤
k. 吸水紙
l. 切紙刀
m. 尺子
n. 鉛筆
2) RNA 電泳裝置
a. 水平電泳槽，相應的梳子，制膠盤
b．電泳儀
3) 轉印與雜交的試驗材料
a．尼龍膜（推薦使用Ambion公司的BrightStar-Plus membranes, 可以最大限度的降低背景的影響，還可以增強雜交信號。）
b．雜交管和雜交爐
c．密封袋
d．紫外燈（用于RNA的交聯）
4．探針
實驗步驟
1. 探針的制備
1) 根據相應序列設計用作探針，盡量長一些，50bp以上。
2) 稀釋探針使其最終濃度達到50ng/μL，稀釋液用標記試劑盒中的TE buffer，（公式為摩爾數×分子量/50）。
3) 在開始標記前準備一塊新的96孔板，放置于冰上。
4) 將要標記的探針放在PCR儀上，100℃變性15min（10μL/PCR管）。
5) 變性結束后迅速將探針放置于冰水浴中。
6) 在預冷的96孔板中加入變性好的探針，再于每孔中加入1μL的生物素標記物（BrightStarStar Psoralen-Biotin，使用前先將Psoralen-Biotin溶解在33μL Dimethyformamide中）。
7) 混勻，365nm紫外燈下直接照射45min，樣品和燈源的距離不能超過2cm。
8) 以上步驟6、7必須在暗室中操作，紫外燈照射后用89μL的TE溶液稀釋到100μL。
9) 稀釋好的探針用200μL的飽和丁醇抽提兩次，7,000rpm離心，棄上層丁醇（盡量吸干凈）。
10) 標記好的探針-80℃凍存。
2. 制膠和點樣：
1) 稱取1.5克瓊脂粉加入135mL0.1%的DEPC水。
2) 在微波爐中加熱溶解，開始時膠溫度很高，取1mL封住膠槽的兩邊，用手按住擋板，直至其凝固，待剩余的膠溫度下降后，加入15mL 10×Denauring Gel Buffer(試劑盒中有)，混勻，然后將膠全部加到膠槽中，膠厚度為0.8-1cm。
3) 樣品的處理：取20μL細胞總RNA加入45μL的Formaldehyde Load Dye（試劑盒中有），再于其中加入2μL的EB，混勻后PCR儀上65℃變性15min。然后立即放入冰浴中，冰浴時間不定，放入要迅速，冰浴的時間可長可短，什么時候有時間，什么時候取出來。）
4) 準備變性的電泳液，10×MOPS Gel Running Buffer稀釋到使用濃度（70mL的10×MOPS Gel Running Buffer，在其中加入630mL的0.1%的DEPC水），共700mL的電泳緩沖液）。
5) 膠凝固（凝固后要測量膠的尺寸）后開始上樣，使用相同探針的幾個樣品要在一起跑，相同的樣品做一個重復，要同時設陽性對照和陰性對照。（膠凝固后，在外面把擋板和梳子拔出）
6) 加樣后開始電泳，50V 8小時。（直接將電泳制膠槽放在電泳槽中跑電泳即可，電泳儀時間要設好，以防止人不在的時候電泳自動停止）
3. 轉印：
1) 先將膠取出（直接把制膠盤一塊取出，帶上RNase Zap，紙巾，于RNase Zap處理的成像儀上拍照，拍完后小心的將膠移上電泳制膠板，注意不要讓膠滑出，將膠轉移放置在一張保鮮膜上，取膠時將保鮮膜拉至桌邊，邊移動邊扯保鮮膜），倒出電泳液（順便可以沖洗一下膠），膠需要用Transfer Buffer 清洗一下。
2) 取出BrightStar-Plustm Membranes 將其切割成與膠等大的膜（前面電泳時已量好，可再量），切5張濾紙和一張濾紙橋，同時將所需要的紙塔（吸水紙）切好，3cm厚。（在取膠之前做好）
3) 切好的膜放在0.1%的DEPC水中浸泡。（用一個搪瓷托盤，放置入0.1%的DEPC水，將切好的膜先放入其中）
4) 把制膠盤放入電泳槽中，再在電泳槽中將濾紙橋放到里面（可以是30cm），加入Transfer Buffer 濕潤后再放兩張與膜等大的濾紙（一定要排除氣泡，用制膠的擋板排除氣泡），膠放到濾紙上要正面朝上，膜放在膠上，再加三張濾紙在膜上，最后將草紙放在濾紙上，加重物（可用電泳槽的蓋子，500g即可）在上面，封好電泳槽（用保鮮膜封，只要左右邊緣抵住草紙，防止Transfer Buffer自然揮發，轉印過夜。（在放置各層時一定要排除氣泡）
4. 雜交：
1) 轉印過夜后帶好刀，尺子，鉛筆，RNaseZap，卷紙，切出樣品條帶，拍照，并做好標記。
2) 開始雜交，首先將ULTRAhyb雜交液在雜交管中68℃預熱，5mL/50cm2。
3) 取下重物，并且將轉印好的膜和膠分別在紫外燈下成像看轉印效率，分別在膜上標記。
4) 將標記好的膜放到預熱的ULTRAhyb雜交液中，42℃預雜交30min，探針分別是歐洲株和北美株的3’端序列。
5) 用1mL已預熱的ULTRAhyb雜交液稀釋10μL探針。
6) 將稀釋好的探針加到雜交管中，42℃雜交過夜。
5. 洗滌和顯色成像
1) 洗滌液時要用20mL/100cm2，所有的洗滌液要37℃溶解后使用。
2) 用low stringency washing在室溫洗滌5min，連續洗滌兩次，在雜交爐儀。
3) 用High stringency washing在42℃洗滌15min，連續洗滌兩次，在雜交爐儀。
4) 膜在Wash Buffer中洗滌5min，連續兩次。
5) 將膜在Blocking Buffer中孵育5min，連續兩次。
6) 膜在Blocking Buffer中孵育30min。
7) 用10mL Blocking Buffer稀釋1uLStrep-AP，用該稀釋溶液將膜在雜交管中孵育30min。
8) 將膜在Blocking Buffer中孵育10min。
9) 用Wash Buffer將膜洗滌5min，連續洗滌3次。
10) 用1×Assay Buffer將膜洗滌2min，連續洗滌兩次，0.5mL Assay Buffer/cm2。
11) 用CDP－Star將膜孵育5min，5mL/ cm2。。
12) 在一張濾紙上去除殘留的CDP-Star，不能讓膜完全的干了。
13) 將膜密封在雜交袋內，暗室中操作將膜放在X-光膠片上成像。
14) 曝光后的第二天開始洗相片。