P1噬菌體普遍性轉導實驗

實驗方法原理

細菌病毒（噬菌體）分為烈性噬菌體和溫和噬菌體。烈性噬菌體感染細胞后，伴隨著細胞裂解會釋放出新的子代噬菌體顆粒。被溫和噬菌體感染的細胞或是裂解，釋放出新的子代噬菌體顆粒，或是成為溶源狀態，噬菌體的基因組整合到細菌染色體上，與細菌染色體一起復制，這時的噬菌體基因組稱為原噬菌體（prophage）。

轉導是指以噬菌體作為媒介將一個細胞的遺傳物質傳遞給另一細胞的過程。轉導可分為局限性轉導（specialized transduction）和普遍性轉導（generalized transduction），前者只能轉導與原噬菌體整合位點相鄰接的少數寄主細胞染色體基因，而后者能轉導寄主細胞的任何一個基因，因此，局限性轉導噬菌體既含有噬菌體的遺傳物質，也含有寄主細胞的遺傳信息。 這種噬菌體（例如 λ 噬菌體）已經被改建為合適的載體，可以攜帶外源基因，廣泛應用于基因的克隆（cloning）。

普遍性轉導噬菌體 P1 幾乎只包裝寄主細胞的染色體片斷。P1 噬菌體的 DNA 相對分子質量為 58×106， 大約相當于大腸桿菌染色體的百分之二，把大腸桿菌染色體全長定為 100 min， 那么 P1 噬菌體包裝的 DNA 片斷上可以帶有相隔 2 min 范圍內的寄主基因，而不大可能帶有相隔 2 min 以上的基因。

本實驗所用的轉導噬菌體是 P1 cml，clr100，帶有氯霉素抗性標記（cml），在 42℃ 能形成透明的菌斑（clr），在 32℃ 則形成混濁的噬菌斑，因此，在含氯霉素的培養基上很容易選得帶該噬菌體的溶源菌，溶源菌經 42℃ 高溫誘導就可以釋放出 P1 噬菌體。

實驗材料 大腸桿菌

試劑、試劑盒 CaCl2氯仿 盛無菌生理鹽水試管培養基盛LB 液試管LB 固體培養基平板LB 半固體培養基試管乳糖色氨酸基本培養基平板 葡萄糖基本培養基平板葡萄糖色氨酸基本培養基平板

儀器、耗材 無菌試管無菌吸管臺式離心機

實驗步驟

1. P1 cml，clr 裂解液的制備

1.1 接種供體菌于 5 ml LB 培養液中，30℃ 振蕩培養過夜。

1.2 將培養過夜的供體菌液按 1：5 稀釋于 5 ml LB 液體中，振蕩培養 2 h。

1.3 吸取 0.2 ml 菌液與 10-2 的 P1 cml， clr 噬菌體原液 0.1 ml 于上層 LB 半固體瓊脂中，混勻后倒在底層 LB 固體培養基上，待凝固后置 37℃ 恒溫箱培養過夜（共做四皿）。同時做一皿不加噬菌體的對照。

噬菌體原液的效價應每毫升 109 左右，細菌和噬菌體數的比大約是 20：1，以保證每個噬菌體都有機會感染一個細菌，半固體瓊脂應先溶化，然后保溫在 45℃ 左右，使之既不凝固，又不燙死細胞。

1.4 將噬菌體已增殖的上層半固體培養基瓊脂刮到無菌三角瓶中，加入 5～10 ml LB 液體并加入幾滴氯仿，劇烈振蕩 20 s 后離心，上清液即為 P1 cml，clr 裂解液。將上淸液移到無菌試管中，加入幾漓滴氯仿，再次劇烈振蕩 20s 即可。

2. P1 cml，clr100 裂解液噬菌體效價的測定

在轉導時要求噬菌體與細菌之比（即感染復數）要小于 1，因此，在進行轉導實驗之前需對噬菌體裂解液進行效價測定。

2.1 將 30℃ 中培養過夜的供體菌液按 1：5 加到 2 支盛有 5 ml LB 液體的試管中，30℃ 振蕩培養 3 h 后， 混合 2 支試管中的菌液。

2.2 分別吸取 0.9 ml 菌液于 11 支無菌試管中，然后吸取如上制得的噬菌體裂解液 0.1 ml 于第一支菌液中，用 10 倍稀釋法稀釋成 10-1～10-10。在稀釋的同時，取不同的稀釋度的噬菌體細菌混合液 0.2 ml 加到 3 ml 的 LB 半固體中（融后保溫在 45℃ 左右），搖勻后倒在 LB 固體培養基平板上。其中一支菌液不加噬體裂解液，倒一皿作為對照。平板冷凝后置 37℃ 恒溫箱培養過夜。

噬菌體裂解液中加氯仿是為防止細胞污染，一般放冰箱 4℃ 保存。在吸取裂解液時，不要把吸頭伸 a 到試管底部，以免吸進沉在底部的氯仿。

2.3 拿出平板進行噬菌斑計數，然后算出每毫升噬菌體原液中 P1 噬菌體的數目。

3. 轉導

3.1 接種受體菌于 5 ml LB 液體中，30℃ 振蕩培養過夜。

3.2 將上述過夜培養液按 1：5 稀釋于 5 ml LB 液體中，30℃ 振蕩培養 2～3 h 后，在培養液中加入 CaCl2， 使之終濃度為 5×10-3 mol/L（Ca2＋有助于 P1 噬菌體對受體細胞的吸附）。

3.3 取如上制得的噬菌體裂解液（滴定度約為 1010 /ml 左右），用無菌生理鹽水稀釋到 10-3 取 10-1，10-2， 10-3 稀釋裂解液 1.5 ml 分別加入無菌試管，對每支試管再加入 1.5 ml 含有 CaCl2 受體菌培養液。

3.4 37℃ 保溫 20 min， 取出后離心（3500 r/min，15 min），棄去上淸液后加入 1 ml 無菌生理鹽水重新懸浮。

3.5 分別取重新懸浮液 0.1 ml 涂布在二種選擇性培養基上（乳糖色氨酸基本培養基各涂 2 皿，葡萄糖基本培養基各涂 1 皿），并取未經噬菌體處理的受體菌液在二種選擇培養基上各涂一皿作為對照，置 37℃ 恒溫箱培養 2 d。

3.6 同時將含有 CaCl2 的受體菌液用無菌生理鹽水稀釋到 10-6，取 10-5 和 10-6 稀釋菌液涂布在葡萄糖色氨酸基本培養基上，每皿涂布 0.1 ml，每稀釋度涂布 3 皿，置 37℃ 恒溫箱培養 2 d。

3.7 取出平板，進行菌落計數，計算轉導頻率。