PCR擴增制備帶標記探針

實驗概要

用標記脫氧單核苷酸部分代替PCR反應體系中的脫氧核苷酸（一般是帶標記的dUTP代替dTTP），經PCR擴增后標記基團隨機攙入擴增產物－DNA探針中。這樣使探針濃度高，可檢測標記基團量多，靈敏度高，與缺口平移法制備探針相比，具有方便簡捷的特點，并且由于具高靈敏度因此在檢測低豐度，低拷貝數的目的片斷時，尤其有效。一般可用來進行攙入的帶標記基團可以為同位素標記基團、臭化脫氧尿苷標記基團、也可為其他非放標記基團如生物素、地高辛等。下面以生物素和地高辛為例介紹探針的PCR標記技術。

實驗步驟

1. 生物素標記

應用bio-11-dUTP部分替代dTTP攙入PCR擴增探針中

   1) 配制反應體系

dNTP的組成  dATP、dCTP、dGTP各20mmol，dTTP 15mmol，bio-11-dUTP 5mmol混勻，其他試劑如常規PCR。

   2) 25循環后，凍存，取出化凍，趁下層水相尚在冰凍狀態，吸盡石蠟油

   3) 水相中20mg/ml糖原1ul，pH5.2 2.5MnaAC10ul，220ul無水乙醇。混勻后－20℃過夜

   4) 離心取沉淀，冷凍干燥后100ul水或TE復溶。

2. 地高辛標記

應用dig-11-dUTP部分替代dTTP攙入PCR擴增探針中

   1) 配制反應體系

dNTP的組成  dATP、dCTP、dGTP各200umol，dTTP 130umol，bio-11-dUTP 70umol混勻，其他試劑如常規PCR。

   2) 35循環擴增產物

30 擴增產物純化與DIG隨機標記探針方法相同（僅沉淀時，50ulPCR反應液中加入5ul4MliCl和150ul冰乙醇）。

注意事項

1. 標記時標記基團在dNTP中占的比例不能太高，因標記基團與dTTP相比具位阻效應，比例太高PCR擴增及以后的雜交都要受到影響。

2. 靶DNA用量不能太高，生物素標記中控制在0.2fmol左右；地高辛標記中可低至0.1ng。