丙肝是世界廣泛流行的傳染病,我國丙肝感染率為3.2%,其中約有60~85%可發展成慢性肝炎,其中約有20%發展成肝硬化,少數會發展成原發性肝癌。丙肝是由丙型肝炎病毒(Hepatitis CVirus,HCV)引起的一種血液傳播性疾病。丙肝病毒慢性感染可導致肝臟慢性炎癥壞死和纖維化,部分患者可發展為肝硬化甚至肝細胞癌(HCC),對患者的健康和生命危害極大,已成為嚴重的社會和公共衛生問題。因此,早發現、早治療是預防丙肝的最有效的方法。
丙肝病毒RNA(HCV-RNA)臨床檢測是丙肝確診、治療的重要檢查項目,丙肝病毒檢測可以準確診斷出被檢查者是否感染丙肝病毒,HCV-RNA是丙肝病毒檢測的一個重要指標之一,建議丙肝高危人群主動去醫院做丙肝病毒檢測,一旦患病,早發現早治療。
丙肝病毒RNA檢測有定性和定量檢測兩種,HCV-RNA定性檢測主要檢測病毒的陰陽性狀,這是確診丙型肝炎和初步評估丙肝治療效果的一個重要的指標; HCV-RNA定量檢測,能精確的檢測出丙肝病毒HCV-RNA的數量,是一種精確地檢測,可以檢測到病毒數量103以下。如果丙肝抗體和丙肝病毒HCV-RNA檢測均為陽性或者HCV-RNA數量大于103,則可明確是感染了丙肝病毒,需要積極進行治療。HCV-RNA陽性是HCV傳染的直接證據,是HCV復制指標有傳染性。因HCV-RNA較抗-HCV出現早,故可用于早期診斷及獻血員的篩查。在HCV急性感染期,在血漿或血清中的病毒基因組水平可達到105~107拷貝/ml。在HCV慢性感染者中,HCV-RNA水平在不同個體之間存在很大差異,變化范圍在5×104~5×106拷貝/ml之間,但同一名患者的血液中HCV-RNA水平相對穩定,故HCV-RNA可用于藥物療效監測。HCV-RNA陰性,說明HCV被清除,因此也可做為判斷預后和效果的指標。
實時熒光定量PCR技術是在定性PCR技術基礎上發展起來的核酸定量技術,是一種在PCR反應體系中加入熒光基團,利用對熒光信號積累的實時檢測來監測整個PCR進程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。該技術不僅實現了對 DNA/RNA模板的定量,而且具有靈敏度和特異性高、能實現多重反應、自動化程度高、無污染、實時和準確等特點。
但在HCV-RNA檢測中,丙肝患者應注意可能存在假陽性和假陰性結果。HCV-RNA熒光定量檢測被認為是診斷HCV病毒血癥的“金標準”,能夠直接反應HCV病毒的復制情況,而且窗口期短,是HCV感染的直接依據。血標本在離開人體后,仍會發生各種反應,其檢測結果易受多種因素的影響。由于溶血標本中存在的血紅蛋白可以抑制Taq酶的活性,致使定量結果偏低,甚至出現假陰性結果。雖然目前大多數熒光定量PCR試劑盒試劑盒使用核酸提取柱提取RNA,該方法即使存在高濃度血紅蛋白等干擾物質在用柱抽提的過程中被完全去除,但是血細胞破裂會有大量核糖核酸酶釋放而使提取模板的RNA降解,這必然導致定量結果降低,因此被檢樣本決不能溶血。未經處理的脂血標本在加樣過程中因脂肪顆粒占有一定體積而引起血清加樣量相對減少;脂肪或其代謝產物也能與Taq酶相互作用,抑制Taq酶的活性,導致檢測結果降低。由于RNA為單鏈,極不穩定,且易被RNA酶降解,因此應在取血后盡快提取RNA,如不能做到,則需分離出血漿或血清進行冷凍保存,短期(1-2周)保存在-20℃下,較長期保存在-70℃。用于丙肝RNA測定使用EDTA抗凝全血標本或不加抗凝劑,抗凝標本6小時內分離血漿,嚴禁使用肝素,使用血清標本需盡快(2小時內)分離血清。