| 實驗步驟 | 材料與設備
提取液〔0.2% 脫氧膽酸鈉 (DOC) 上清，見實驗 1，P.146~147〕
Tissuc-TearorTM 勻漿器（Fisher Scientific 15-338-55)
硫酸銨 (AMS)
試劑
聚乙烯亞胺 (PEI)(10% 儲液,pH7.9)
緩沖液 A
緩沖液 A+0.3mol/LNaCl
緩沖液 A+0,9mol/LNaCl
二硫蘇糖醇 (DTT)(0.1moVL)
(配方，見“試剤的配制” PP.I84~189)
操作程序
1) 將 0.75 ml10%PEI 液加入體積約為 24 ml 的可溶性提取物 (0.2%DOC 上清) 中, 使 PEI 終濃度為 0.3%。混合后，4°C 下靜置 15 min。
方案補充實驗：加 PEI 前，取 6x50ul 的 0.2%DC 上清，用以確定沉淀σ32 和 RNA 聚合酶所需的 PEI 量（見 p.174)。加入 PEI 后，再取 6X50ul 的 PEI 懸液，用以確定從 PEI 沉淀物洗脫σ32 和 RNA 聚合酶所箱的鹽量 (見 P.175)。
2) 懸液于 4°C、5000r/min 離心 10 min。上清棄去前留樣（樣品 E)。保留沉淀物。
3) 對 PEI 沉淀物，加 20 ml 緩沖液 A+0.3mol/L NaCl, 在低鹽濃度下洗滌沉淀物。用 Tissue-Tearor 勻漿器劇烈重懸沉淀物后，于 4°C 下至少靜置 10 min。
4) 懸液于 5000r/min 離心 10 min。上清棄去前留樣（樣品 F)。保留沉淀物。
注：低鹽洗滌可從 PEI 沉淀物中洗掉某些蛋白質，而留下游離的和復合于核心 RNA 聚合酶的σ32。這一步大致等同于從 DEAE-Sepharose 柱的低分辨率的鹽洗脫。
5) 對 PEI 沉淀物，加 20 ml 緩沖液 A+0.9mol/L NaCl，進行高鹽洗脫。用 Tissue Tearor 勻漿器劇烈重懸沉淀物后，于 4°C 下至少靜置 10 min。
6) 懸液于 4°C、13000r/min 離心 10 min。傾出并保留上清（是為高鹽洗脫物)。取樣（樣品 G)。
注：高鹽洗脫，釋出復合于核心 RNA 聚合海的σ32, 而其他物質（大部分為核酸）則留于沉淀。沉淀會相當多。
7）為除去髙鹽洗脫物中的 PEI, 每 20 ml 慢慢加入 7.6 g AMS, 得 55% 飽和 AMS 溶液。不斷攪拌混合，直至所有的 AMS 全部溶解。于冰上靜置過夜（或至少 30 min)。再加 20ul 0.1mol/L DTT, 使 DTT 終濃度為 0.1 mmol/L。
8)4°C、13000r/min 離心 10 min。上清棄去前留樣（樣品 H)。沉淀物于冰箱保存過夜。
注：AMS 是通過增強疏水作用而使蛋白質沉淀的。55% 飽和 AMS 帑液可沉淀出大部分蛋白質，而將 PEI 和少量蛋白質留于上清。達到沉淀所需的 AMS 量隨蛋白質及其濃度而異。 展開 |
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