RTPCR經驗淺談

RT-PCR成敗的關鍵首先在于RNA模板的制備
以問者的口氣
應該是做RNA病毒基因的RT-PCR
本人三年前做過一個正鏈RNA病毒全基因組分段擴增
設計方案是將全基因組分成7個片段，0.6kb-3.3kb不等
分別進行RT-PCR擴增
剛開始的三個月
我們課題組三個人辛辛苦苦
什么招都想過了
結果連一個片段都沒有拿到

后來有一個周末
我一個人安安靜靜做了一天
PCR跑膠的結果足以讓我興奮一個月：
一下子隱隱約約出了3個片段！！！
緊接著把膠里的弱帶切下
水溶并后做二次擴增
很快，三個預期的片段都得到了理想的擴增
后來大家也可以想象
不到一個月
12kb的全基因組各片段全部收歸囊下

小聲地告訴各位
我這次成功的關鍵在于
提取RNA時，收集沉淀這一步
離心速度不要低于13000rpm（r=5cm）
提高離心速度、延長離心時間
在離心前的沉淀也盡可能在低溫下長時間進行
這些時我本人總結出來的經驗

在后來的實驗中
幾乎每次RT-PCR都非常順利
除了
材料本身就沒有目標基因

BTW:
我甚至還不知道如何用DEPC對實驗用具進行繁瑣的處理
可能大家還不相信吧