Science：有比CRISPRCas更安全的技術嗎？基于retroelement的基因組編輯工具

　　在一篇展望文章中，Stephen Tang和Samuel Sternberg討論了基于retroelement的基因編輯作為CRISPR-Cas方法的一種更安全的替代方法。

　　精確的基因組編輯技術改變了現代生物學。可編程DNA靶向的能力已經迅速提高，這主要是由于細菌RNA引導的CRISPR-Cas系統的發展，這種方法允許精確切割目標DNA序列。然而，CRISPR-Cas9系統會產生DNA雙鏈斷裂(DSB)，激活細胞DNA修復途徑，從而導致不需要的復雜副產物，包括大的染色體缺失和易位，從而導致安全性問題。

　　不過越來越多的研究表明，利用可移動遺傳元件，特別是逆轉錄元件，可以作為CRISPR-Cas系統的替代方案。在這篇最新文章中，研究人員指出逆轉錄因子是靶向基因組工程的潛在有用工具，因為它們是內源性DNA片段，使用宿主的RNA聚合酶產生自身的RNA副本，然后通過逆轉錄因子編碼的逆轉錄酶將其轉化為互補DNA (cDNA)。

　　之后通過一系列不需要DSB的機制將該cDNA產物整合到基因組中。最近對逆轉錄元件編碼的蛋白質-RNA復合物的結構和功能的研究已經開始解決這些能力背后機制的分子細節，“揭示了重新設計它們用于可編程DNA插入的令人興奮的機會，”作者寫道。

　　移動遺傳因子（MGEs）存在于所有生物體中，它們編碼的酶可促進自身 DNA 在基因組內和基因組間的移動。MGEs 有兩大類：DNA 轉座子和逆轉錄子，可根據其擴散機制加以區分。DNA 轉座子通常編碼轉座酶，通過將序列從其原始位置切除并整合到目標基因座（"剪切-粘貼"）來移動 DNA。相比之下，逆轉錄酶依賴宿主細胞的 RNA 聚合酶來生成該元件的 RNA 副本，然后將其作為模板，由逆轉錄酶編碼的逆轉錄酶（RT）合成互補 DNA（cDNA）。然后，這種 cDNA 產物通過一系列機制被整合到基因組中，形成原始 DNA 片段的新拷貝（"復制粘貼"）。

　　MGEs 是基因組編輯應用的天然候選者。它們無處不在，反映了安全高效地將 DNA 整合到宿主基因組的微調能力。然而，MGEs 通常對整合位點表現出隨機或固定的特異性，這限制了它們在可編程 DNA 插入方面的用途。這與基于 CRISPR 的基因組編輯不同，Cas9 核酸酶可由用戶定義的引導 RNA（gRNA）引導，以幾乎任何感興趣的 DNA 序列為目標。

　　但在傳統的 Cas9 基因組編輯中，DNA 靶向和編輯是兩個獨立的過程： Cas9 能識別并切割靶序列，產生 DNA 雙鏈斷裂（DSB），激活細胞 DNA 修復途徑，對序列進行永久性編輯。這一過程會引入大量異質性，并可能導致不必要的副產品，如染色體大缺失和易位，從而引起對產生 DSB 的基因組編輯方法安全性的擔憂。

　　因此，CRISPR-Cas 系統和 MGEs 在靶位點特異性和遺傳毒性方面表現出互補的優缺點。理想的基因組工程工具應融合兩者的能力，直接將可編程 DNA 靶向與目標位點的無 DSB 修飾結合起來。

　　20 多年來，Retroelements一直是基因組工程工具包的一部分，但直到最近，它們在定向 DNA 插入方面的作用還很有限。例如，targetrons 是經過修飾的細菌 II 組內含子，通過與內含子 RNA 的堿基配對相互作用，將用戶指定的 DNA 序列歸位，從而催化反向剪接到目標位點。雖然靶向子已被用于靶向基因破壞，但由于對合成貨物的耐受性差，阻礙了將其用于轉基因插入的工程設計。Retron是最近加入工具包的一種細菌逆轉錄子，已被設計用于從RNA模板產生供體DNA，以同源定向修復CRISPR-Cas9裂解位點。然而，反轉錄子介導的方法只應用于小規模編輯，而且它們對產生 DSB 的依賴會給臨床基因編輯帶來安全風險。因此，Targetrons 和 retrons 展示了利用逆轉錄素進行生物技術的前景，但它們還沒有達到逆轉錄素介導的基因組編輯工具的終極能力：將任何新的 DNA 序列直接寫入任何基因組靶位點。

　　最近的兩項研究利用低溫電子顯微鏡確定了家蠶 R2 RT 與 R2 RNA 和 28S DNA 靶標結合的三維結構。這揭示了 RT-RNADNA 復合物中特定的分子相互作用，表明逆轉錄轉座子通過 R2 蛋白的序列識別選擇其 RNA 模板和 DNA 靶標。這些結構細節被用來設計合成 R2 RNA，其中包括最小識別序列和 "貨物 "RNA 附屬物。R2 RT 能識別這種工程底物，并能被 Cas9 改變方向，在生化反應中將貨物結合到非 28S 靶序列上。

　　利用逆轉錄酶作為靶向基因插入工具已經奠定了堅實的基礎。然而，這方面的知識仍然存在重大差距。例如，R2 RT 產生的 cDNA 的基因組整合需要合成第二條 cDNA 鏈，但這一過程的機制細節尚不清楚。旨在解決 R2 逆轉錄最后步驟的分子要求的其他研究對于 R2 在細胞中進行轉基因插入工程至關重要。此外，還沒有報道過系統分析 TPRT 精確性的方法。開發此類方法對于評估逆轉錄酶介導的基因組編輯策略的安全性至關重要。

　　自然界中存在大量的逆轉錄酶，但只有少數逆轉錄酶的基因組編輯潛力得到了研究。某些具有未知特性的 RT 酶可能天生就非常適合基因組編輯任務。通過生物信息學分析和集合篩選對逆轉錄酶多樣性進行系統挖掘，對于鑒定具有理想特性的 RT 酶將是非常寶貴的。這種策略已經在開發緊湊型素編輯器方面取得了成果。還值得注意的是，逆源因子在人類基因組的形成過程中已經發揮了巨大作用，其中大約一半來自 MGEs。因此，在開發基于逆源因子的 DNA 編輯工具時，人類正在重新利用自然界最初的基因組工程師。