轉印后的濾膜在預雜交液中溫育4-6h，即可加入標記的探針DNA（探針DNA預先經加熱變性成為單鏈DNA分子），即可進行雜交反應。雜交是在相對高離子強度的緩沖鹽溶液中進行。雜交過夜，然后在較高溫度下用鹽溶液洗膜。離子強度越低，溫度越高，雜交的嚴格程度越高，也就是說，只有探針和待測順序之間有非常高的同源性時，才能在低鹽高溫的雜交條件下結合。
