5.7.1 分析方法
間 的 底 物 孵 育 會 延 長 信 號 持 續 時 間 。使 用 W e s t P i c o 或 W e s t D u r a 底 物 能 檢 測 到 低 至10 n g 的 蛋 白 質 , 甚 至 在 完 成 蛋 白 質 印 跡 的 64 h 后 依 然 可 以 檢 測 到 信 號 。 W e s t D u r a 比W est P ic o 的 底 物 更 敏 感 和 持 久 。盡 管 W e s t D u r a 在 檢 測 5 n g 蛋 白 質 時 能 產 生 極 強 信號, 但泳道中含量超過 100 n g 會 導 致 信 號 迅 速 消 失 ，這 強 調 了 局 靈 敏 度 檢 測 系 統 下 米 用適 量 靶 蛋 白 的 重 要 性 。
通 常 用 脫 脂 牛 奶 溶 液 孵 育 印 跡 以 最 小 化 背 景 信 號 。改 變 封 閉 液 中 牛 奶 的 濃 度 不 會 產生 假 帶 。 令 人 吃 驚 的 是 ，封 閉 液 中 含 0 . 5 % 脫 脂 牛 奶 可 以 增 強 低 豐 度 蛋 白 質 的 檢 測(圖 33. 7A ); 然 而 ，抗 體 同 封 閉 蛋 白 質 的 交 叉 反 應 確 實 會 引 起 假 帶 。如 果 一 抗 或 二 抗 同牛 奶 蛋 白 質 相 結 合 ，這 些 封 閉 的 位 點 化 學 發 光 ，產 生 深 色 背 景 ，而 樣 品 蛋 白 質 集 中 于 膜 表面 ，形 成 白 色 條 帶 (圖 33. 7B )。
高 濃 度 的 酶 聯 二 抗 與 大 量 靶 蛋 白 結 合 時 會 增 強 底 物 的 催 化 作 用 ，從 而 導 致 信 號 迅 速消 失 ，使 這 些 區 域 內 的 底 物 迅 速 耗 盡 。膜 上 轉 移 的 大 量 蛋 白 質 可 與 大 量 H R P 連 接 的 二抗 相 結 合 。這 些 免 疫 復 合 物 集 中 區 域 內 產 物（也 就 是 信 號）的 過 度 產 生 會 使 底 物 迅 速 耗盡 ，造 成 假 帶 。總 之 ，凝 膠 過 量 上 樣 、二 抗 濃 度 過 高 、底 物 孵 育 未 達 到 最 優 化 的 時 間 ，以及抗 體 與 封 閉 區 的 交 叉 反 應 均 可 引 起 假 帶 。在 使 用 髙 靈 敏 度 檢 測 系 統 時 ，優 化 蛋 白 質 印 跡參 數 對 于 防 止 假 帶 的 產 生 是 極 其 至 關 重 要 的
六、使用化學發光底物的印跡法和操作規程的優化
6.1 使 用 化 學 發 光 底 物 的 蛋 白 質 印 跡 法
(1) 凝膠電泳分離蛋白質樣品。
(2) 制備轉移緩沖液。采 用 4 〇 0 m L 超 純 水 制 備 Tris— 甘氨酸轉移緩沖液，再加人IOOmL 甲醇。 4°C 下 使 用 和 保 存 該 轉 移 緩 沖 液 。注 ： 轉 移 緩 沖 液 ： 25 mm 〇 I/LTris、192 mmol,L 甘氨酸 (pH8_ 0),2 0 % 甲醇。
(3) 為濕轉移制作凝膠「三明治」(圖 33.8)。對于半干的轉移，在陰極和陽極間按同樣的步驟制作三明治。， : 在三明治裝配前將襯墊和濾紙浸泡在轉移緩沖液中。
⑷將蛋白質從滅膠轉移到膜上。濕轉移時如果使用為 g cmX1 〇 c m 凝設計的迷你轉移裝置，則 40 V 轉 移 90min, 并保持緩沖液溫度為4 ℃ 。半干型轉移時,15 v 轉移90 min。注: 通過凝膠染色或膜可逆染色來確定轉移是否成功。
(5) 取下膜』 在封閉緩沖液中室溫 (R T ) 搖晃孵育 2 〇?60 min ，以封閉膜上的非特異結合位點。
(6) 用 含 1 0 % 封閉液的一抗溶液孵育膜并振搖丄 h 。如果需要的話將印跡在 2?8℃過夜孵育。
(7) 清洗 膜 3 次 ，每 次 5 min』 可 用 Tris-鹽緩沖液 (TBS)、磷酸鹽緩沖液 (pBS 域 其 他
(9) 清 洗 膜 5 次 ，每 次 5 m in 以除去未能結合的酶聯物。酶聯物孵育后徹底清洗膜是至關重要的。
(10) 制備底物。使用足量底物以確保膜完全浸濕 (0.1 mL/cm2), 且膜不能變干。
(11) 用電化學發光 (ECL) 孵 育 膜 I m in, 或 使 用 SuperSignal 底物孵育 5 m in。
(12) 將膜從底物中移出并放置在塑料片保護器內。盡管塑料保鮮膜也能起作用，但是硬質的塑料片做成的保護器作用更好。移除所有在膜和膜保護器表面之間的氣泡。
(13) 通過膠片或冷 CCD 照相機進行印跡成像。
6.2 蛋白質印跡去除方案
采 用 化 學 發 光 底 物 的 眾 多 好 處 之 一 個 就 是 能 夠 移 除 所 有 檢 測 試 劑（Kaufmannet al.,1087)。這些移除方法對于沉淀底物是無效的，并且用于熒光染料顯色的膜時結果各異。
(1) 制備蛋白質印跡膜剝離液。使用下述剝離液中的一種：
① Restore W estern Blot Stripping Buffer(Therm o Fisher Scientific 公司產品）
② 0?I m o l / L 甘氨酸- H C K p H 2. 5?3. 0);
③ 50 m m o l / L Tris-H C l (p H 7 ) 、2 % S D S 、50 m m o l / L D T T 。 注 : 現 配 現 用 。
(2) 將待除去印跡的膜放在蛋白質印跡剝離液中。使用足量溶液確保膜完全潮濕(每 8 c m X 10 c m 膜對應約 20 m L 剝離液)。注: 可能會出現一些靶蛋白的變性和損失。
(3) 室溫孵育 5?15 m in。為追求最佳結果，需要優化孵育時間和孵育溫度。某些相互作用至少需要 15 m in, 可能還需要 37°C 孵育 。如果使用緩沖液③,70°C 孵 育 30 m in。
(4) 將印跡從蛋白質印跡膜剝離液中移出，用洗滌緩沖液清洗 (P B S / T B S 或其他含有 0.0 5 % T w e e n - 2 0 的生理緩沖液）。
(5) 要測試酶聯物和一抗是否完全移除, 可進行下列實驗。若兩種情況下都能檢測到信號，就重復步驟 (2)?(4)，剝離時間額外增加 5?15 m in 或 將 溫 度 提 高 至 37°C 。優化去除時間和溫度以確保在不損傷抗原的同時將抗體完全移除
① 要測試酶聯物是否完全移除, 將膜用底物孵育并印跡成像。 5 m m 膠片曝光后若沒有信號被檢測到，那么表示酶聯物已經被成功移除。
② 要測試一抗是否完全移除，將膜用酶聯物賻育并用洗滌緩沖液清洗。再用底物孵育并印跡成像。 5 m in 膠片曝光后若沒有信號被檢測到，那么表示一抗已經被成功移除。
確定膜已經恰當地剝離以后, 開始進行第二次檢測實驗。通常，印跡可以被剝離和再檢測數次, 但可能會需要更長的曝光時間或更敏感的底物。如果抗原不穩定, 之后的再檢測可能會導致信號衰減。需要對單獨系統進行分析。注: 剝離后通常不需要再次封閉薄膜 ，但在某些系統中卻需要這么做。
6.3 抗 原 來 度 的 優 化
(1) 用 SDS^ A G E 樣品緩沖液制備不同濃度的蛋白質樣品。測試較大范圍的蛋白質濃度，需要注意所使用底物的檢測極限。
(2) 凝膠中每種濃度的樣品要等量，通過電泳進行分離。將樣品轉移到膜上。
注 ： 最佳濃度的粗指示可使用點印跡。使用盡可能少的量將抗原稀釋物點在干燥膜條上。使膜干燥 5?10 m in 或直到沒有可見潮濕痕跡，再進行步驟 (3)。
(3) 用標準封閉試劑封閉膜，加入一抗, 隨后將酶聯物結合膜。如果還沒有確定最優稀釋度，就根據底物敏感度采用中等范圍的稀釋度。
(4) 清洗膜，加入底物。按要求進行印跡成像。
6.4 膜 封 閉 的 優 化
(1) 用電泳分離蛋白質樣品并轉移至膜上，或如先前所述將蛋白質樣品點在膜上。
(2) 根據待測試的條件的個數，將膜條從膜上切下來。下述組合物應該用每一種封閉劑測試。①封閉劑+ —抗 + 酶聯物+ 底 物 ；② 封 閉 劑 + 酶 聯 物 + 底 物 ；③ 封 閉 劑 +底物。
(3) 將膜條加入到各種封閉液中, 確保其完全浸泡在溶液中。每個膜條都室溫振搖孵 育 I h 。
(4) 在各組中加入含 10% 封閉劑的一抗和/或酶聯物。如果還沒有確定最優稀釋度，就 根 據 底 物 敏 感 度 采 用 中 等 范 圍 稀 釋 度 。
(5) 清 洗 膜 ，加 入 底 物 。按 要 求 進 行 印 跡 成 像 。
注 ：將 封 閉 后 的 膜 用 底 物 孵 育 , 以 檢 査 封 閉 劑 或 樣 品 中 內 源 的 過 氧 化 酶 活 性 。如 果檢 測 到 信 號 ，就 在 封 閉 步 驟 后 使 用 其 他 的 封 閉 緩 沖 液 或 使 用 過 氧 化 酶 抑 制 劑 。封 閉 緩 沖液 用 量 大 時 會 最 大 限 度 地 減 少 非 特 異 信 號 。
6.5 — 抗 農 度 的 優 化
( 1 ) 電 泳 分 離 蛋 白 質 樣 品 并 轉 移 到 膜 上 。或 者 ，如 本 章 6. 3 節 所 述 將 蛋 白 質 樣 品 點在 膜 上 。用 適 當 封 閉 劑 封 閉 膜 。根 據 待 測 試 的 一 抗 條 件 的 個 數 將 膜 條 從 膜 上 切 下 來 。
(2) 在 含 1/10 體積封閉劑的清洗緩沖液中制備一抗的稀釋液，并將其加人到膜條上 。室溫孵育 I h。
(3) 清 洗 膜 條 ，室 溫 下 用 酶 聯 物 孵 育 l h 。再 次 清 洗 并 用 適 當 的 底 物 顯 現 信 號 。用 膠片 或 C C D 照 相 機 檢 測 信 號 。
注 ：先 用 一 抗 工 作 液 孵 育 膜 ，再 用 酶 聯 物 工 作 液 孵 育 ，以 檢 查 一 抗 與 封 閉 劑 的 非 特 異性 結 合 。如 果 觀 察 到 信 號 ，通 過 使 用 其 他 的 封 閉 劑 或 較 少 量 的 一 抗 來 解 決 此 問 題 。
6.6 膜 清 洗 的 優 化
⑴ 使 用 洗 滌 緩 沖 液 ，如 P B S 或 T B S 或 其 他 含 0. 05% tween2 0 的 生 理 緩 沖 液 。
(2) — 抗 孵 育 后 , 振 搖 清 洗 膜 至 少 3 次 , 每 次 5 m m ; 酶 聯 物 孵 育 后 ，振 搖 清 洗 膜 至 少 5次 ，每 次 5 m i n 。
(3) 如 果 在 最 終 檢 測 中 出 現 非 特 異 性 背 景 ，使 用 更 大 量 的 洗 滌 緩 沖 液 或 增 加 每 次 清洗 的 用 量 和 時 間 。如 果 仍 沒 有 改 善 , 問 題 就 在 于 其 他 變 量 。
6.7 酶 聯 物 農 度 的 優 化
當檢測一個新的蛋白質印跡系統的最佳濃度時， 一 個簡單的實驗通常可以補救許多因信號變動帶來的問題。
(1) 在 3 個 (或更多) 凝膠孔中加入同樣用量的目標物。
(2) 電泳分離蛋白質樣品并轉移到膜上。封閉非特異結合位點，結合一抗。
(3) 清洗后，將含目標物的印跡切成膜條。
⑷以不同酶聯物濃度結合膜條。例如，X 寸于 SuperSignal West Pico Substrate 使用1 : 40 000、1 : 60 000 和 1 : 80 000 的稀釋度 (取自 I mg/mL 儲備液）。室溫下振搖孵育條 帶 I h。
(5) 清洗膜條，加入底物。底物孵育后，進行膜條成像。
(6) 等 待 1?2 h，再次進行膜條成像。
(7) 結果評估。選取能產生最強信號的稀釋度。
6.8 檢 測 方 法 的 優 化
(1) 電泳分離蛋白質樣品并轉移到膜上，或 如 本 章 6. 3 節描述將蛋白質樣品點在膜 上 。
(2) 封閉非特異結合位點，在 含 有 1/10 封閉劑的體系中結合一抗和酶聯物。
(3) 如果抗體濃度尚未優化，選擇一個中等范圍的稀釋度。每次孵育后都要清洗膜。
(4) 根據待測試的底物曝光條件的個數從膜上切下膜條。制備待測試的底物工作 液 。
(5) 以制造商說明為準，用底物孵育膜條一段時間。
(6) 用鑷子將底物中的膜條移出，在紙巾上輕拍條帶邊緣以移除過剩的底物。
(7) 將膜條放在塑料薄膜上, 按不同時間長度對其成像。選取一個有清晰信號和低背景的時間。注:CCD 照相機可能比膠片需要稍長的曝光時間。