WesternBlotProtocol實驗步驟

一、提取抗原蛋白  

將提取RNA途中留存的樣品，加入150μl100%酒精充分混勻，靜置5min(RT),2000×g,4℃離心5min,吸取上清至新管中,加入750μl異丙醇,混勻,靜置10min(RT),12000×g,4℃離心10min,棄上清,加入1ml0.3mol/L鹽酸胍/95%酒精重懸沉淀,用加樣器打散沉淀,混旋20~30秒,靜置20min(RT),7500×g,4℃離心5min,棄上清,重新加入1ml0.3mol/L鹽酸胍/95%酒精兩次,重懸沉淀,離心后棄上清,加入100%無水乙醇1ml,混旋1min,靜置20min(RT),7500×g,4℃離心5min,棄上清,真空干燥5min,50μl1%SDS溶解沉淀，用50℃熱水助溶，直至全部溶解。10000×g,離心10min,去除沉渣。  

二、蛋白定量  

1.取PBS、各樣品10ul，加DW990ul  

2.取DW勻漿緩沖液、樣品稀釋液、系列牛血清白蛋白標準濃度0.5ml。  

3.向各管加入2.5mlD試劑（A50ml＋B0.5ml＋C0.5mlA－2%Na2CO3、0.1NNaOH，B－0.5%CuSO4，C－1%酒石酸鈉）混勻，靜置10分鐘。  

4.迅速加入酚試劑0.25ml，混勻37℃水浴30分鐘。  

5.721分光光度計650nm，比色，S0標準管調零。  

6.最后稀釋為4ug/ul，加載樣緩沖液后，終濃度為2ug/ul，上樣量為30～80ug/泳道。  

三、電泳  

1.makegel． 
  11%分離膠 12ml 兩塊膠          4%積層膠6ml兩塊膠 
  DW            4.36 ml            DW        堵漏     3.66ml 
 3M  Tris        3.0 ml        0.5M  Tris           1.5 ml 
  30%Arc         4.4 ml        30%Arc    0.5 ml     0.78 ml 
  10%SDS        0.24 ml        10%SDS              60 ul 
  10%APS        0.12 ml        10%APS    20ul      30 ul 
  TEMED         10ul        TEMED     5ul       6ul 

2.上樣前樣品處理：  
樣品100℃、3分鐘、冷卻，900×g、離心30S。  
3.通電電：積層膠電泳電壓50V左右，分離膠電泳電壓90～110V。  
4.考馬斯亮藍染色：1小時，1號脫色1小時，2號脫色2小時。  

四、電轉印  

1.將濾紙NcM切成與凝膠尺寸大小，置于DM中浸透5分鐘，電轉液平衡15分鐘。  
2.轉移：用二張大濾紙貼于兩張多孔墊料，將NcM、膠夾于中間，在NcM與大濾紙之間墊小濾紙。NcM朝正極，20V恒壓轉移12小時。取下NcM雜交，凝膠染色看效果。  

五、雜交  

1.取下NcM，做好標記，dH2O沖洗，室溫濾紙干或放入膜固定液15分鐘。  
2.NcM用PBS沖洗二遍，呈5～6%non－fatmilk的pH7.2的PBS中封閉，室溫６－８小時或室溫1－2小時，4℃，過夜。  
3.將封閉的膜用ＰＢＳ沖洗一遍，洗15分鐘×1，5分鐘×2。