實驗概要
免疫印跡是一個用于蛋白質分析的常規技術，在電場的作用下將電泳分離的蛋白從凝膠轉移至一種固相支持物，然后利用抗原—抗體的特異性反應，從蛋白混合物中檢測出目標蛋白，從而定量或定性地確定正常或實驗條件下細胞或組織中目標蛋白的表達情況。Western
blot還可用于蛋白—蛋白、蛋白—DNA和蛋白—RNA相互作用的后續分析，作為一種廉價、便捷、可靠的研究工具，將與質譜和蛋白質芯片等技術一起在蛋白質組時代發揮重要作用
主要試劑
細胞蛋白抽提試劑盒、蛋白濃度檢測試劑盒、預染蛋白質分子量標準、10×碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液、電轉緩沖液、SDS-PAGE蛋白電泳液、10×TBST、Western封閉液、5 × SDS 蛋白上樣緩沖液
主要設備
垂直電泳槽、電轉印槽、電泳儀、PVDF轉印膜
實驗步驟
（1）準備蛋白樣品
①裂解細胞、抽提蛋白。目前已經有很多試劑公司提供抽提細胞全蛋白和亞細胞組分蛋白的試劑盒，可根據實際需要選用。需要注意的是，裂解液中務必要加入蛋白酶抑制劑合劑（protease
inhibitor cocktail），以防止蛋白降解；如果提取的是磷酸化蛋白，則還要加入磷酸酶抑制劑合劑 (phosphatase
inhibitor cocktail)以防止磷酸化蛋白降解。
②收集完蛋白樣品后，為確保每個蛋白樣品的上樣量一致，需要測定每個蛋白樣品的蛋白濃度。根據所使用的裂解液的不同，需要采用適當的蛋白濃度測定方法。因為不同的蛋白濃度測定方法對于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大。可根據實際需要選擇商品化的與抽提蛋白試劑盒配套的蛋白濃度測定試劑盒。（2）SDS-PAGE
1）SDS-PAGE凝膠配制
SDS-PAGE凝膠可以參考《分子克隆實驗指南》進行配制。目前許多試劑公司也提供了商品化的SDS-PAGE凝膠配制試劑盒，為研究人員提供了更便捷的實驗操作。
2）樣品處理
①在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的SDS- PAGE蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積，在相同體積的上樣孔內可以上樣更多的蛋白樣品。
②100℃或沸水浴加熱3～5 min，以使蛋白充分變性。
3）上樣與電泳
①按垂直電泳槽使用說明書將制好的SDS-PAGE膠版組裝在電泳槽上，注好1×SDS-PAGE蛋白電泳液。注意不要漏液。
②拔掉凝膠上的梳子，用力要均勻，避免上樣孔扭曲。
③蛋白樣品冷卻到室溫后，用微量注射器或移液器把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內。為了便于觀察電泳效果和轉膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，有一個加樣孔加入預染蛋白質分子量標準。
④接通垂直電泳槽電源，開始電泳。
注意：通常樣品還在濃縮膠部分時，建議使用低電壓恒壓電泳；而在樣品（溴酚藍指示）進入分離膠時，建議使用高電壓恒壓電泳。對于Bio-Rad的標準電泳裝置或類似電泳裝置，低電壓可以設置在80～100V，高電壓可以設置在120V左右。
為了電泳方便起見，也可以采用整個SDS-PAGE過程恒壓的方式，通常把電壓設置在100V，然后設定定時時間為90～120 min。設置定時可以避免電泳時間過長使目的蛋白跑出SDS-PAGE膠。
⑤通常電泳時溴酚藍到達膠的底端處附近即可停止電泳，或者可以根據預染蛋白質分子量標準的電泳情況，預計目的蛋白已經被適當分離后即可停止電泳。
注意：電泳中常出現的現象和原因如表2-2所示
表2-2 電泳中常出現的現象及原因
| 現象 | 原因 |
| ︶條帶呈笑臉狀 | 凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好 |
| ︵條帶呈皺眉狀 | 可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全 |
| 拖尾 | 樣品溶解不好，或含鹽 |
| 紋理（縱向條紋） | 樣品中含有不溶性顆粒 |
| 條帶偏斜 | 電極不平衡或者加樣位置偏斜 |
| 條帶兩邊擴散 | 加樣量過多 |
（3）轉膜
轉膜有濕轉和干轉法，這里著重介紹濕轉法。
①用塑料板輕輕地將兩塊玻璃板撬開，這個過程可以在電轉緩沖液中進行，能有效防止膠破損。
②將凝膠上的濃縮膠和沒有點樣的孔道切去，根據剩余膠的大小準備3～4層濾紙2份和PVDF膜一張，PVDF膜適當大于濾紙或者膠。
③將凝膠、濾紙和海綿浸泡于電轉緩沖液中10～30 min，PVDF膜先置于甲醇中處理10 s，然后浸于電轉緩沖液中10 min。
④在電轉夾上從負極向正極按次序放置：海綿—濾紙—凝膠—PVDF膜—濾紙—海綿
注意：務必用玻璃棒小心排盡凝膠和PVDF膜之間的氣泡。
⑤電轉夾夾緊后放入電轉槽中，把電轉夾的負極對著電轉槽的負極，加滿電轉緩沖液。
⑥把電轉槽放到裝滿冰的盆中，接通電流，條件為200 mA恒流2 h。
注意：在不同的實驗中，應根據具體蛋白適當調整轉膜條件，例如對70 kD以上的蛋白須適當延長轉移時間。
⑦電轉結束后用鑷子取出PVDF膜。
（4）抗體雜交與顯色
①封閉：用Western封閉液于室溫處理PVDF膜1 h，在脫色搖床晃動。
②一抗反應：在Western封閉液中加入一抗（稀釋倍數參照一抗說明書），在4℃下反應過夜。內參一般用a-TUBULIN的抗體（1:2000）。
③洗膜：用TBST洗膜3次，每次5～15 min。
④二抗反應：在Western封閉液中加入二抗（稀釋倍數參照二抗說明書），室溫孵育2 h。
⑤洗膜：用TBST洗膜3次，每次5～15 min。
⑥顯色：根據二抗所偶聯的酶，選擇顯色方法。