1. YAC中心實驗室用于篩選文庫的方法進展很快。
2. 將一塊或多塊微量滴定板微孔中的YAC克隆轉印到尼龍膜上,用單拷貝探針進行雜交,就可以篩選YAC文庫了。
3. 然而,由 于雜交實驗的信噪比較低以及制備所有的轉印尼龍膜所需的花費巨大,絕大多數實驗室已采用PCR方法來篩選文庫。
4. 這種方法首先是從克隆集中提取DNA,一般每個克隆集代表1~4塊微量滴定板。
5. 然后將從克隆集中提取的DNA合并成一 個更大的超集,約含1 500~2 000個YAC克隆。
6. 用PCR方法篩選這些克隆集和超集,就可以從中找出包含至少一個擴增克隆的候選微量滴定板。
7. 最終的克隆確認可通過采用PCR產物作探針進行常規的菌落雜交,或將微量滴定板按列或行分組再進行PCR分析, 逐步縮小范圍最終獲得YAC陽性克隆。
8. 驗證PCR分析方法的特異性、反應參數、和篩選 復雜的YAC克隆集和亞集一般要花費2~6周時間。 展開 |