沉淀σ32和RNA聚合酶實驗
試劑、試劑盒聚乙烯亞胺儀器、耗材SDS-PAGE 電泳裝置聚丙烯酰胺小膠實驗步驟材料與設備SDS-PAGE 電泳裝置聚丙烯酰胺小膠（10%)試劑聚乙烯亞胺（PEI)(6% 儲液，pH7.9)(配方，見“試劑的配制”，pp.184~189)操作程序1)0.2%DOC 上清 (見 p.153), 取 6x50-ul 等分試樣。各試樣分別加入 0、1、2、3、4 和 5ul 6%PEI 儲液（使 PEI 濃度分別為 0%、0.12%,0.24%、0.36%、0.48% 和 0,6%), 充分混勻，孵育 5~10 min。2) 用微型離心機離心 1ml，離下沉淀物。如需要，取上清樣品，供快速蛋白質斑點印跡試驗（見 PP.172?173) 或 SDS 凝膠電泳分析用。做斑點印跡試驗應立即進行。結果典型的顯示 PEI 滴定實驗結果的 SDS 凝膠照片，見圖 3-5。展開......閱讀全文
T7RNA聚合酶系統基因表達實驗（二）
單病毒感染OST7-1細胞實驗方法原理OST7-1 細胞來源于鼠 L929 細胞，能在細胞質中持續表達噬菌體 T7 RNA 聚合酶，因此，應用此細胞系無需用 vTF7-3 感染細胞。實驗材料貼壁培養的單層 OST7-1 細胞含有 pT7 控制的外源基因的重組病毒儲液試劑、試劑盒完全 MEM-2.5
T7－RNA聚合酶/啟動子表達實驗
實驗材料 載體試劑、試劑盒 氨芐青霉素卡那霉素pGP裂解緩沖液儀器、耗材 培養箱分光光度計離心機實驗步驟 1. ?將含有待表達基因的片段亞克隆于pT7-5、pT-6或pT7-7中，轉化一種標準大腸桿菌菌株，此菌株不應帶有可指導T7 RNA聚合酶合成的質粒。轉化物涂布于氨芐青霉素平皿，于37℃溫育培養
用－Taq－DNA－聚合酶進行雙脫氧測序反應實驗
試劑、試劑盒 去離子蒸餾水ddNTPdNTP甲酰胺加樣緩沖液。酶和緩沖液。Taq 酶或類似的熱穩定 DNA 聚合酶Taq 酶稀釋緩沖液核酸和寡核苷酸寡核苷酸引物模板 DNA(100ug ul) 溶于 TE 中放射性化合物5'32P 標記的寡核苷酸引物儀器、耗材 微量離心管（0.5 ml) 或
T7RNA聚合酶系統基因表達實驗（一）
本節介紹依賴于在哺乳動物細胞質合成噬菌體T7 RNA聚合酶的瞬時細胞質表達系統。首先，將感興趣的基因插入質粒中，使其位于T7 RNA聚合酶啟動子（PT7）的控制下。在培養過程中，外源基因被高效的 T7 RNA聚合酶轉錄。這種轉染方案適用于分析的目的，因為不需要構建新的重組病毒，所以比較簡單。對于大規
T7－RNA聚合酶/啟動子表達實驗
基本方案 備選方案 備選方案2 ? ? ? ? ? ? 實驗材料 載體 試劑、
熒光RNA隨機引物觸發的聚合酶鏈反應實驗（一）
實驗步驟 ##一、 從組織和培養細胞中分離RNA1.TRIzol試 劑（Invitrogen)。該試劑含有苯酚和硫氰酸鹽化合物，操作時應穿實驗服，戴手套，存放于 4°C 。2.氯仿。3.異丙醇。4.乙醇。5.焦炭酸二乙酯（DEPC) 處理的水。6.無DNA試劑盒（Ambion)。貯存于一 20°C
T7－RNA聚合酶/啟動子表達實驗3
實驗材料噬菌體試劑、試劑盒PEGIPTG儀器、耗材培養箱離心機實驗步驟1. ?制備從M13噬菌體mGP1-2原種，加PEG溶液沉淀濃縮噬菌體。重懸噬菌體于M9培養基，滴定其滴度。?2. ?將由“基本方案”步驟1所得的含T7 啟動子表達質粒轉化M13許可性大腸桿菌細胞，轉化物涂布于氨芐青霉素平皿上，3
T7－RNA聚合酶/啟動子表達實驗2
實驗材料蛋白質試劑、試劑盒氨基酸混合物M9培養基甲硫氨酸甲醇儀器、耗材熒光顯微鏡離心機分光光度計實驗步驟1. ?將含有待表達基因的片段亞克隆于pT7-5、pT-6或pT7-7中，轉化一種標準大腸桿菌菌株，此菌株不應帶有可指導T7 RNA聚合酶合成的質粒。轉化物涂布于氨芐青霉素平皿，于37℃溫育培養過
實驗室常用的耐熱DNA聚合酶的相關介紹
耐熱DNA聚合酶多應用在PCR技術中。各種耐熱DNA聚合酶均具有5'-3'聚合酶活性，但不一定具有3'-5'和5'-3'的外切酶活性。3'-5'外切酶活性可以消除 錯配，切 平末端；5'-3'外切酶活性可以消除合成障
熒光RNA隨機引物觸發的聚合酶鏈反應實驗（二）
##六、從組織或培養細胞提取 RNARNA可以從各種來源的樣本包括培養的細胞（例如神經元細胞、肝細胞等）和組織中分離得到（見 注 釋 1) 。 mRNA 的 純 化 對 FRAP-PCR 方法來說并不需要，因為mRNA 僅占細胞總 R N A 的 3 % ?5 % (13)。因而在本章所描述
T7－RNA聚合酶/啟動子表達實驗1
在適宜的條件下，T7 RNA聚合酶/啟動子系統表達的基因產物可占細胞總蛋白的25%以上，但多數情況下產量比這個比例要低得多。實驗材料載體試劑、試劑盒氨芐青霉素卡那霉素pGP裂解緩沖液儀器、耗材培養箱分光光度計離心機實驗步驟1. ?將含有待表達基因的片段亞克隆于pT7-5、pT-6或pT7-7中，轉化
聚合酶的分類
可分為以下幾個類群:(1)依賴DNA的DNA聚合酶；(2)依賴RNA的DNA聚合酶；(3)依賴DNA的RNA聚合酶；(4)依賴RNA的RNA聚合酶。前兩者是DNA聚合酶，它使DNA復制鏈按模板順序延長。如在原核生物中僅就大腸桿菌中已被發現的就有三種(分別簡稱為PolⅠ，PolⅡ和PolⅢ等)；DNA
聚合酶的分類
可分為以下幾個類群:(1)依賴DNA的DNA聚合酶；(2)依賴RNA的DNA聚合酶；(3)依賴DNA的RNA聚合酶；(4)依賴RNA的RNA聚合酶。前兩者是DNA聚合酶，它使DNA復制鏈按模板順序延長。如在原核生物中僅就大腸桿菌中已被發現的就有三種(分別簡稱為PolⅠ，PolⅡ和PolⅢ等)；D
PCRSSCP（聚合酶鏈反應單鏈構象多態）實驗步驟
一. 樣品的制備1. 設計引物。用Oliga6.0對目的基因進行分析，設定引物，引物長度18-21個堿基，擴增片段以200-300bp最為合適。2. PCR擴增并檢測。根據不同的引物挑選適合的退火溫度進行PCR擴增。擴增產物用2-2.5%的瓊脂糖膠跑水平電泳檢測，上樣量3-5ul。PCR產物為 10
RNA干涉實驗——采用RNA聚合酶Ⅲ啟動子表達siRNA分子
實驗方法原理因為哺乳動物細胞不具備低等真核生物細胞所具有的擴增 RNAi 信號的機制，因此人工合成或體外轉錄的 siRNA 分子在細胞內的作用是瞬時性的，不適合用于進行靶基因的表達受到抑制后細胞表型的長期變化觀察，也不適于進行文庫的篩選。此外，體外制備 siRNA 分子的成本比較高，而且 siRNA
激活的熱穩定－DNA－聚合酶進行反轉錄和－DNA－擴增實驗
本實驗介紹激活的熱穩定 DNA 聚合酶進行反轉錄和 DNA 擴增。本實驗來源于 PCR 實驗指南（第二版），作者：種康，瞿禮嘉。試劑、試劑盒RNA寡核苷酸引物脫氧核苷三磷酸RT RNA PCR 酶AccuRT 緩沖液UNG瓊脂糖溴化乙錠二甲基亞砜乙酸鎂去除 RNA 酶的水SYBRGreen I Dy
激活的熱穩定－DNA－聚合酶進行反轉錄和－DNA－擴增實驗
試劑、試劑盒 RNA寡核苷酸引物脫氧核苷三磷酸RT RNA PCR 酶AccuRT 緩沖液UNG瓊脂糖溴化乙錠二甲基亞砜乙酸鎂去除 RNA 酶的水SYBRGreen I Dye儀器、耗材 瓊脂糖凝膠的電泳設備實驗步驟 一、材料1. 緩沖液、溶液和試劑瓊脂糖二甲基亞砜（見注釋 1)(DMSO)溴化乙錠
大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ－Klenow片段實驗——標記DNA的3‘末端
實驗方法原理選用本方法可產生用于放射自顯影的32P末端標記分子量標志物。放射自顯影帶的強度與片段長度無關，標記DNA可穩定數月之久。?實驗材料DNA試劑、試劑盒dNTP儀器、耗材水浴鍋實驗步驟1. ?在20 μl 反應體積中，用可產生5’突出端的限制性內切酶消化0.1~0.4 μg DNA。?2.
激活的熱穩定－DNA－聚合酶進行反轉錄和－DNA－擴增實驗
? ? ? ? ? ? 試劑、試劑盒 RNA寡核苷酸引物 脫氧核苷三磷酸 RT RNA PCR 酶 AccuRT 緩沖液 UNG 瓊脂糖 溴化乙錠
聚合酶鏈[式]反應
中文名稱聚合酶鏈[式]反應英文名稱polymerase chain reaction;PCR定 義通過DNA互補雙鏈解鏈、退火和聚合延伸的多次循環來擴增DNA特定序列的方法。應用學科細胞生物學（一級學科），細胞生物學技術（二級學科）
定量聚合酶鏈反應
中文名稱定量聚合酶鏈反應英文名稱quantitative PCR;qPCR定 義將某種已知含量的DNA模板作為內標準進行PCR反應，對待測模板進行定量分析的方法。更靈敏的定量PCR是采用實時PCR方法。應用學科細胞生物學（一級學科），細胞生物學技術（二級學科）
耐熱DNA聚合酶簡介
耐熱DNA 聚合酶(Taq DNA 聚合酶)：1969年人們從美國黃石國家森林公園火山溫泉中分離出一種嗜熱的水生真菌Thermusaquaticus,能在70~ 75C生長,從該菌分離純化得到一種耐熱的、依賴DNA 的DNA 聚合酶,簡稱Taq DNA 聚合酶。 耐熱DNA聚合酶是一種可抗高溫
DNA聚合酶的發現
在50年代的中期，A. Kornberg和他的同事們就想到DNA的復制必然是一種酶的催化作用，于是決心分離出這種酶并研究其結構和作用機制。為了達到這個目的，他們分離的蛋白，然后加到體外合成系統中即 同位素標記的dNTP、Mg2+及模板DNA，經過大量的工作，于1956年終于發現了DNA聚合酶Ⅰ（
聚合酶的基本特性
聚合作用在引物RNA'-OH末端，以dNTP為底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ逐個將核苷酸加上去，就是DNApolⅠ的聚合作用。酶的專一性主要表現為新進入的脫氧核苷酸必須與模板DNA配對時才有催化作用。dNTP進入結合位點后，可能使酶的構象發生變化，促進3'-OH與5
DNA聚合酶及其應用
（一）大腸桿菌DNA聚合酶I是Kornberg A. 1956年首先從大腸桿菌E。Coli 細胞中分離出來的。它是一種多功能性的酶，包括 3種不同的酶活力：5′→ 3′聚合酶活性（模板， 帶3′－OH游離基團的引物、4dNTPs、 Mg2+ ）。雙鏈特異性的5'→3'核酸外切酶活性。
RNA聚合酶的特點
RNA聚合酶催化RNA的合成，其與DNA聚合酶有許多相同的催化特點：①以DNA為模板；②催化核苷酸通過聚合反應合成核酸；③聚合反應是核苷酸形成3’，5’一磷酸二酯鍵的反應；④以3’→5’方向閱讀模板，5’→3’方向合成核酸；⑤按照堿基配對原則忠實轉錄模板序列。
DNA聚合酶的功能
[1] 聚合作用：在引物RNA'-OH末端，以dNTP為底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ逐個將核苷酸 加上去，就是DNApolⅠ的聚合作用。 酶的專一性主要表現為新進入的脫氧核苷酸必須與模板DNA配對時才有 催化作用。dNTP進入結合位點后，可能使酶的 構象發生變化，促進3&
RNA聚合酶的結構
為什么細菌的RNA聚合酶需要這么大和復雜的分子結構呢?而某些噬菌體特有的RNA聚合酶則要小得多，僅由一條多肽鏈組成。這證明RNA合成所需的機構可以遠比宿主的酶小。這種情況說明，噬菌體內的轉錄僅需一條"最小"的機構。然而這種酶只能識別噬菌體本身所有的少數幾個啟動子；它們不能識別其他啟動子。例如噬菌
DNA聚合酶及其應用
（一）大腸桿菌DNA聚合酶I是Kornberg A. 1956年首先從大腸桿菌E。Coli 細胞中分離出來的。它是一種多功能性的酶，包括 3種不同的酶活力：5′→ 3′聚合酶活性（模板， 帶3′－OH游離基團的引物、4dNTPs、 Mg2+ ）。雙鏈特異性的5'→3'核酸外切酶活性。
RNA聚合酶的分類
通常可根據生物的類別，將RNA聚合酶分為原核生物RNA聚合酶、真核生物RNA聚合酶。原核生物和真核生物的RNA聚合酶有共同特點，但在結構、組成和性質等方面又不盡相同。（1）原核生物RNA聚合酶 研究得最清楚的是大腸桿菌RNA聚合酶。該酶是由五種亞基組成的六聚體（α2ββ'ωσ）分子量約500