視網膜母細胞瘤的發病是由于視網膜母細胞瘤基因的失活引起的。視網膜母細胞瘤基因是人類發現的第一種抑癌基因，其蛋白質產物在人體內發揮著例如調節分化、轉錄、細胞周期等重要的作用。
RB基因與其蛋白表達物的失活會導致細胞分裂不受控制地、非正常地增長而發生永生化（immortalization），最終引發腫瘤。這種基因失活可能是因為其缺失、突變或者不表達。對于家族遺傳性患者，其出生前生殖細胞中RB基因已經發生過一次突變，在還有一個正常的等位基因沒有發生突變的情況下，該等位基因通常會由于偶然的原因失活而不被表達，發生雜合性丟失（LOH, Lost of Zygosity）進而引發癌癥。而對于非家族性遺傳患者而言，需要發生兩次突變才會發病，這種幾率相對較低。其它的突變類型包括：無功能突變（Null allele）、啟動子突變等。
從蛋白水平來說，正常細胞中具有活性的RB蛋白（pRB）在細胞中保持著低磷酸化或無磷酸化的狀態，它與細胞周期調節因子E2F結合，抑制E2F的活性從而抑制了G1期到S期的進行，也就抑制了轉錄活性。實驗證明pRB的失活會使其無法與E2F結合，因此活化的E2F就會促進G1/S細胞周期的進行。
RB蛋白的失活途徑有以下幾種：
基因突變導致RB蛋白失活。
細胞周期調節蛋白Cyclin-D與Cdk4（Cyclin-dependent kinase 4，細胞周期蛋白依賴激酶4）、Cdk6結合形成的活性物質可以使pRB被磷酸化進而失活一些病毒蛋白如腺病毒E1A蛋白、SV40T癌病毒蛋白、乳頭狀病毒HPV16 E7蛋白等可以與pRB上的特異性結合位點“口袋區（Pocket region）”進行結合，導致E2F無法在此區域與RB蛋白結合，引起蛋白功能的失效RB蛋白在某些情況下不僅僅失活，2005年的一份文獻顯示在人體內的MDM2蛋白在過度表達的情況下會使pRB通過蛋白酶體介導的途徑被降解，使pRB無法發揮其應有的功能。