摘要：
已開發出一種新型的microRNA（miRNA）的定量方法，即利用莖環反轉錄，Taqman PCR分析。莖環RT引物在RT 效率和特異性方面比傳統的更好。TaqMan miRNA的檢測是很具體的，可以檢測成熟miRNA和區分相關的甚至低至一個核苷酸的miRNAs。此外，他們不會受到基因組DNA污染的影響。精確量化可以從低至25皮克的總RNA中提取大多數miRNA。
事實上，這種方法靈敏度高，特異性強和精密度高，允許無需核酸純化，直接分析單個細胞。
如標準TaqMan基因表達分析，TaqMan
miRNA的檢測顯示出了7個數量級的動態范圍。七個小鼠組織中五個miRNA定量顯示，在每個細胞中，有低至10到超過30000個拷貝數。這種方法可以確保快速，準確，靈敏miRNA表達譜，并能識別和監控特定組織或疾病的潛在生物標志物。莖環RT-PCR可用于其他小RNA分子，如短干擾RNA（siRNAs）的量化。此外，為更好的特異性和效率，莖環RT引物設計的概念可以應用在小分子RNA克隆和多重檢測。
引言：
miRNA是自然發生的，高度保守的轉錄家庭，來源于較大的發夾前體。miRNA是在動物和植物的基因組上發現的。到目前為止，有1000個獨特的轉錄產物，其中，在桑格中心miRNA的注冊表中包括326人類miRNA。
miRNA是通過催化mRNA的分裂或抑制mRNA的翻譯來調節基因表達。他們被認為在細胞發育，分化和傳導中發揮著重要作用。具體職責包括調節細胞增殖和新陳代謝，發育時間，細胞死亡，造血，神經發育，人類腫瘤形成與DNA甲基化和染色質修飾。
雖然miRNA的相對豐富的轉錄產物類別，其表達水平在物種和組織之間相差很大。低豐度的miRNA經常逃避檢測技術，如克隆，Northern雜交和基因芯片分析。這里，我們提出一種新型實時定量方法，能夠準確靈敏地檢測miRNA與其他小分子RNA。這種方法擴展了實時PCR技術，從大分子的基因表達到微分子的變化檢測。
材料和方法
從桑格中心的miRNA注冊網站 http://www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna/index.shtml
中篩選目標，引物和探針。所有TaqMan miRNA檢測，可通過應用生物系統公司（P /
N4365409）得到。miRNA標準TaqMan分析，采用PrimerExpress軟件設計PRI-LET-7A-3和PRI-MIR-26B和miRNA前體miR-30A。所有序列在補充資料部分可用。合成miRNA的寡核苷酸從Integrated
DNA Technolo-gies (IDT, Coralville, IA)購買。
RNA樣本組織，細胞，細胞裂解物和總RNA制備
從Ambion公司（P /
N7810，7812，7814，7816，7818，7824，7826和7968）購買10-12天老鼠的腦，心，肝，肺，胸腺，卵巢和胚胎的總RNA樣品。
Ambion公司鼠的總RNA來自瑞士韋伯斯特小鼠。基于TaqMan基因表達分析人類或小鼠的3 - 磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）內對照（P /
N4310884E4352339E，應用生物系統公司）所有的RNA樣品進行標準化。
兩個細胞株HepG2和OP9，培養，使用Gibco公司MEM（P / N 12492-021，Invitrogen，Carlsbad,
CA）補充10％胎牛血清（FBS）(P/N: SH30070.01, HyClone, Logan,
UT)培養。用血球計對胰酶消化細胞計數。約2.8×106個懸浮細胞通過離心沉淀，1500r.p.m.離心5分鐘，用1毫升不添加 MgCl2
and CaCl2的杜爾貝科的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌。
細胞再懸浮于140毫升PBS，并用三種不同的樣品制備方法處理。第一種方法，一個50毫升的樣本（106個細胞）等量的核酸純化裂解液混合，用吸管反復吹打十次，然后旋轉。在添加到RT反應體系前，將裂解液用1 U / ml的RNase抑制劑溶液稀釋1/10。在第二種方法中，用mirVanamiRNA提取試劑盒提取50毫升的樣本（106個細胞）。純化的總RNA在100毫升洗脫緩沖液中洗脫。第三種方法用1×PBS稀釋1/2，95℃加熱5分鐘，在加入RT反應體系前立即在冰上保存。
用mirVana miRNA檢測試劑盒檢測miRNA
根據制造商的協議，使用mirVana-miRNA的檢測試劑盒對miRNA雜交分析。由IDT合成RNA探針。放射性同位素標記的RNA片段用氣旋存儲熒光粉系統進行檢測和定量。
反轉錄酶反應
逆轉錄反應中包含的RNA樣品，包括純化總RNA，細胞裂解物，和熱處理細胞，50納米的莖環RT引物，1×RT緩沖液，每dNTPs濃度0.25毫米，3.33
U / μL 的逆轉錄酶和0.25 U / μL的RNase抑制劑。7.5微升反應體系在9700溫度循環器96- 或
384-平板上16℃培養30分鐘，42℃30分鐘，85℃5分鐘，然后保持4℃。所有逆轉錄反應，包括無模板對照和RT負對照，都進行一次重復。
PCR
采用標準的TaqManPCR試劑盒進行實時PCR。 10μLPCR反應體系包括0.67μLRT產物，1×TaqMan Mix
，0.2μM的TaqMan探針，1.5m M正向引物和0.7μM反向引物。反應在
384-平臺上95℃培養10分鐘，95℃15秒60℃1分鐘40個循環。所有的反應一式三份。 C T為在熒光通過固定閾值的循環數。熒光定量CT值轉換成絕對數量的拷貝數，使用合成林-4 miRNA的標準曲線。
結果
我們提出了一個新的miRNA的定量的實時RT-PCR技術方案。它包括兩個步驟：RT和實時PCR。首先，莖環RT引物是與miRNA分子雜交，然后用Multi-Scribe反轉錄。接下來，用傳統的TaqMan PCR，對RT產品進行定量。
