實驗概要
本實驗構建了pⅧ噬菌粒庫，主要包括：載體的準備，插入片段的準備，連接插入片段與BstⅪ消化的p8V5載體及擴增與儲存。
主要試劑
p8V5噬菌粒載體(AHymaxlnc)
LB氨芐青霉素培養基(1％蛋白胨，0，5％酵母提取物， 0.5％ NaCl，100ug/m1氨芐青霉素)
BstⅪ限制性內切酶(New England biolabs)
10 × NEBuer 3緩沖液 (0.5m01/L Tris-HCl，25℃時調節其pH為7.9， 1mol/L NaCl， 100mm01/L MgCl2，10mmol/L二硫蘇糖醇)
酚：氯仿(1：1)
TE緩沖液(10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA，pH 8.0)
乙酸鉀溶液(分別按10％、15％、 20％、25％質量體積比溶于2mmol/L EDTA溶液中，加溴化乙錠至終濃度為1ug/m1)
Qiagen P1asmid Maxi Kit(Qiagen)
3mol/L乙酸鈉溶液，25℃時調節其pH為5.4
TBE緩沖液 (0.089mol/L Tris-HCl， 0.089mol/L硼酸， 2mmol/L EDTA， pH 8.3)
8％聚丙烯酰胺/7mol/L尿素/TBE凝膠
2×Prep TBE-urea上樣緩沖液 (Invitrogen)
BstⅪ、BsiHKAI限制性生內切酶(New England biOlabs)
5 X DNA聚合酶緩沖液(200mmol/l Tris-HCl，pH 7.5，100mmol/LMgCl2， 250mmol/LNaCl)
DNA聚合酶2.0(sequenase) (Amet-Sham BiOSCiences)
脫氧核糖核苷酸三磷酸混合液(dNTP) (dNTP各為25mm01/L) Microspin S-200 HR柱(Amersham BiOSCience8)
10 X連接緩沖液(500mm01/L Tris-HCl， pH 7.8， 100mmol/L MgCl2，100mm01/L二硫蘇糖醇，1mmol/L三磷酸腺苷，500/(g/m1BSA)
T4DNA連接酶(NewEnglandBl01abs)
E.coli MCl061 F’菌株(Aflyrllaxlnc)
superbroth培養基(3.5％蛋白胨，2％酵母提取物，0.5％NaCl，通過NaOH調節pH至7.5)
SOC培養基(2％蛋白胨，0.5％酵母提取物，10mmol/LNaCl，2.5mmol/L KCl， 10mm01/L MgCl2， 10mm01/L MgSO4，20mm01/L葡萄糖)
LB氨芐青霉素培養基
3mol/L乙酸鈉
SOPamp/glu培養基[2％蛋白胨，1％酵母提取物，100mmol/LNaCl，15mmol/L K2HPO4，5mmol/L MgCl2， pH7.2，100ug/m1氨芐青霉素，0.2％(w/v)葡萄糖]
LB培養基/15％甘油(體積分數)
VSC-M13輔助噬菌體(Stratagene)
20％(w/v)阿拉伯糖
20mg/m1卡那霉素(Kan)
PEG/NaCl(20％聚乙二醇，PEG平均分子量8000，2.5mmol/LNaCl)
磷酸鹽緩沖液(PBS) (0.137mmol/L NaCl， 3mmol/LNa2HPO4，L4mm01/L KH2PO4，27mmol/LKCl，25℃調節pH為7.4)
SOP amp/glu培養基
主要設備
熒光氧化鋁薄層層析板(J.T.Baker)
Microspin Sephadex G-25柱 (Aruer-Sham BiOSCiences)
電轉化儀(E.coli pulser，BiORad)
13 ml離心管(Sarstedt)
實驗步驟
1. 載體的準備
1) p8V5噬菌粒載體DNA提取及用BstⅪ限制性內切酶消化
a. 挑取單克隆MCl061p8V5菌株到5ml LB氨芐培養基中，于37℃振搖培養6～8小時，將培養物加入到含有1LLB氨芐培養基的2.8LFernbach大型錐形瓶中，37℃振搖培養過夜。
b. 依照產品說明，用QiagenPlasmid Maxi柱提取雙鏈噬菌粒質粒DNA，可得到約1mg雙鏈噬菌粒載體DNA。
c. 將200ug p8V5DNA，40ul 10×NEBuffer 3緩沖液和20ul BstⅪ限制性內切酶(200單位)混合，調整終體積為400ul，于55℃酶切過夜。
d. 上述反應物用等體積的酚；氯仿抽提兩次，再用氯仿抽提一次。
e. 抽提物中加入40ul 3mol/L乙酸鈉溶液和880ul乙醇，以沉降DNA。于室溫離心10分鐘后，小心去除上清，DNA沉淀用40ul TE緩沖液重懸。
2) 乙酸鉀梯度離心
a. 緩慢地按濃度遞減逐層加入上述乙酸鉀溶液各1ml于13mm×55mm異質同晶聚合物(polyallomer)超高速離心管中。小心在上層加入200ul消化過的p8V5，使用SW50.1轉子于20℃28000g(48000r/min)離心3小時。
b. 在手提紫外燈下觀察離心管中線性化DNA條帶的位置。用注射器逐層吸出條帶，用水飽和的丁醇抽提數次以除去溴化乙錠。
c. 將上述抽提物的水相與0.1倍體積的3mol/L乙酸鈉溶液以及2倍體積的乙醇混合，室溫離心10分鐘以沉降DNA。小心除去上清后，沉淀用70％乙醇洗滌后重懸于TE緩沖液中。于260nm測定DNA溶液的吸光度值以確定DNA溶液的濃度。
2. 插入片段的準備
1) 寡核苷酸的合成及純化
a. 按照下列序列合成寡核苷酸片段。
ON-1： 5’-GGCCCAGTGCTCACGCA(NNK)nGGAGGCGGGGGTAGC-3’
N為A、G、C、T(等物質的量)①，K為G、T(等物質的量)，n為所需要的隨機氨基酸的個數。
ON-2：5-TAGGGCCCACCTTGCTGGGATCGTCGGAGCCACCTCCCCCACTTCCCCC ACCGCCGCTACCCCCGCCTCC-3’
b. 用2m1 30％NHOH將合成的寡核苷酸片段從合成柱上洗脫，并于55℃放置過夜以脫去DNA合成保護劑。冷凍干燥未經提純的已脫保護的寡核苷酸片段，并用400ul水重懸。于260 nm測定DNA溶液的吸光度值以確定DNA溶液的濃度。
c. 將500Pg兩個寡核苷酸片段分別加入到與之等體積的2XPrepTBE-urea上樣緩沖液中，并上樣于8％聚丙烯酰胺/7mol/L尿素/TBE凝膠(24cm×l5cm，1.5mm封邊墊條)的2cm加樣孔中。其中一個加樣孔中加入含有二甲苯腈的上樣緩沖液，作為指示。
d. 在500V的電壓下電泳直至二甲苯腈移動到凝膠的最底端。取出凝膠并將其放置在熒光氧化鋁薄層層析板的塑料包裝上。通過短波手提紫外燈，可觀察到寡核苷酸所形成的暗帶。將帶切下，放入一個離心管中，并將其搗碎。加入1m1水室溫過夜，以洗脫DNA。
e. 簡單離心以沉淀聚丙烯酰胺凝膠碎片。將上清液轉移到一個新的離心管中，并用真空離心蒸發濃縮器減少溶液的體積至約200ul。然后通過Microspin Sephadex G-25柱將寡核苷酸片段脫鹽。
f. 收集流出液，通過真空離心蒸發濃縮器分別將每個樣品干燥，用水將干燥物重懸。于260nm測定DNA溶液的吸光度值以確定DNA溶液的濃度。
2) DNA補齊反應和限制性內切酶酶切
a. 在離心管中混合以下物質：
100pmol ON-1
100pmol ON-2
10ul 5×DNA聚合酶緩沖液
加水補齊反應總體積至45ul
b. 于70℃孵育5分鐘并緩慢降低溫度到室溫，使兩個寡核苷酸片段退火。
c. 加入2.5ul 25mmol/L dNTP混合物，并加入2.5ul DNA聚合酶2.0(32單位)。于 37℃孵育1小時。
d. 于70℃孵育10分鐘以使DNA聚合酶失活。使用MicrospinS-200 HR柱，通過凝膠過濾層析的方法除去未反應的dNTP。
e. 將40ul補齊后的反應物與20ul NEBuffer 3緩沖液混合。加入10ul BstⅪ和10ul Bis HKAI限制性內切酶，加入120ul水。于55℃放置于有蓋水浴鍋內酶切過夜。
f. 上述反應物用等體積的酚：氯仿抽提兩次，再用氯仿抽提一次。使用MicrospinS-200 HR柱，通過凝膠過濾層析純化消化后的片段。于260nm測定DNA溶液的吸光度值以估算DNA溶液的濃度。
3. 連接插入片段與BstⅪ消化的p8V5載體
1) 連接反應
a. 在13m1離心管中混合下列物質：
20ugp8V5載體(經BstⅪ酶切和純化)
1.25ug插入DNA片段(經BstⅪ、Bsi HKAI酶切和純化)
200ul 10×連接緩沖液
4ul T4 DNA連接酶
加水至反應總體積為2m1
b. 于14℃孵育過夜。加入1/10體積的3mol/L乙酸鈉溶液和2倍體積的乙醇。于10000r/min轉速(JA.20轉子)下離心15分鐘。除去上清，用400ul TE緩沖液將沉淀重懸。再加入1/10體積的3mol/L乙酸鈉溶液和2倍體積的乙醇，離心后將沉淀用70％乙醇洗滌并干燥，再加入20ul TE緩沖液將連接后的DNA重懸。
2) 準備電感受態細胞
a. 培養E.coli MCl061 F菌株于1L superbroth培養基直至對數生長期中期(OD600＝0.5)。
b. 在冰上冷卻培養物30分鐘。于4℃、5000 r/min轉速(JA.20轉子)下離心細菌懸液15分鐘。
c. 用1L冷水將細菌沉淀重懸。重復上面離心步驟，用0.5L冷水將細菌沉淀重懸。
d. 重復上面離心步驟，用10ml 10％甘油將細菌沉淀重懸。于4℃6000r/min轉速下離心細菌懸液15分鐘。
e. 用10％甘油重懸細菌沉淀，至終體積為2m1。按每管200/ul分裝后先于干冰轉移到-70℃冷凍保存。
3) 電轉化
a. 準備4個轉化反應，其中每個電轉化杯中含有200ul細菌和5ul連接后的DNA，于2.5kV電壓下電轉化。轉化后，立即將細菌轉移到2m1SOC培養基中，在無選擇壓的條件下于37℃培養1小時。
b. 將4個轉化反應產物混合，并將取出少量產物以10倍遞減稀釋。將100ul 10-4-10-5。
稀釋液涂布于LB氨芐青霉素瓊脂培養基平板上，根據菌落生長數計算轉化的效率。剩余的轉化反應產物加入到500m1SOPamp/glu培養基中，于37℃振搖培養直至OD600值達到0.8。
c. 取100m1上述培養物，從庫中生成噬菌體。剩余的細胞懸液于6000r/min轉速下離心10分鐘。
d. 用10m1LB培養基/15％甘油重懸細菌沉淀，將其轉移到Nunc凍存管中，每管1m1，并將其于-70℃冷凍保存，以備將來擴增庫之用。
4. 擴增與儲存
1) 輔助噬菌體感染和pⅧ誘導產生
a. 按10:1感染重數加入VSC-M13輔助噬菌體[約1012空斑形成單位(pfu)]到100ml 已轉化的細菌中。于37℃靜置孵育30分鐘。
b. 將上述培養物加入到一個含有500mlSOPamp/glu培養基的三角瓶中。加入0.6 m1卡那霉素溶液和6ml 20％阿拉伯糖溶液。于37℃振搖培養過夜。
2) 收集擴增后的噬菌粒庫
a. 于4℃ 12000g轉速(對于JA-10轉子為8000r/min)將上述過夜培養物離心。將上清轉移到一個新的離心管中，并再次離心。
b. 將上清轉移到另一個新的離心管中，加入0.2倍體積的PEG/NaCl以沉降噬菌體。充分混合后冰上靜置1小時。
c. 于8000r/min離心15分鐘將噬菌體沉降。小心將上清除去，用10ml PBS將噬菌體沉淀重懸。滴定噬菌體儲液；滴定結果出來前，噬菌體懸液可在4℃短期保存24小時。若需要長期保存，可將噬菌體懸液以1000倍庫當量，于-20℃分批凍存。