內源性GPCR功能圖。優化檢測參數后，使用治療相關
GPCRs 的一組 43 個小分子與多肽調節子，對本研究中所用的細胞類型的功能反應進行檢測（參見表 1）。該組藥物指向的24 個受體家族，包括
50種潛在性反應受體，代表所有主要的 GPCR 偶聯類型（Gs、Gi、Gq、G12/13）。使用上文程序進行復孔檢測各細胞類型。
四種腫瘤細胞系HeLa、CHO-K1、U2OS 與 SH-SY5Y 對每種藥物都會生成獨特的時間依賴性細胞曲線（time-dependent
cellular response
profile，TCRP）（數據未顯示）。我們對每孔最大與最小細胞指數值進行測定，該指數值與時間點無關，并以該數值均值與標準差作圖（參見圖
3）。GPCR 功能圖表明，對能引發反應的配體而言，細胞指數值的增加或降低具有顯著差異。例如，HeLa
細胞顯示的細胞指數正向改變程度較大，CHO-K1 細胞顯示的細胞指數負向改變程度較大，包括同樣受體家族中的 GPCRs，如PGE1、2 與
Iloprost 激活前列腺素類受體（參見圖 3）。這些結果表明，細胞背景差異可顯著改變對同樣刺激物的形態學反應，這可能是由于 G
蛋白偶聯的差異，或下游信號傳導途徑的差異，這些差異可使細胞形態學發生改變。細胞指數值的總體模式同樣也可反映出不同 GPCR
配體的相對特異性。SDF1a，即 CXCR4 內源性激活劑，僅可于 HeLa細胞中，誘導出強大的正向細胞指數反應，而降鈣素僅可誘導出
CHO-K1 細胞的強大的負向細胞指數反應。我們也對兩種附加腫瘤細胞系：SH-SY5Y神經母細胞瘤與
U2OS骨肉瘤細胞，以及兩種原代細胞類型：人血管內皮細胞（HUVEC）與混合原代腎上皮細胞（這里簡稱 MREC）的 GPCR 配體進行檢測。
為測定細胞系的相應活性配體，我們將 8 個對照孔的最大與最小細胞指數反應值與固有變異性進行比較。細胞指數值超出或低于對照孔細胞檢測值的三個標準差的檢測孔細胞被視為呈活性反應。配體誘導活性反應見圖3 與 4。每種細胞相應內源性 GPCR 見表 1。
一種或更多細胞類型中，有14種受體家族被確認為活性反應。多種情況下，本研究中使用的內源性配體可激活同樣受體家族的多個成員。例如，血清素可激活所有內源性血清素受體，包括幾種亞家族，其中幾種亞家族具有多種亞型。總之，研究證實，對一種或更多的腫瘤細胞，以及本研究所用的原代細胞中，xCELLigence系統細胞指數圖是一種可靠的方式，可用于對
14 種不同 GPCR 家族進行功能檢測。
圖 3：腫瘤細胞系 GPCR 功能圖。指定類型細胞的檢測如圖 1 所示，于反應板單孔中，對細胞添43 個GPCR調節藥物后的反應進行評價，并進行復孔重復。測定每孔最大與最小的細胞指數值（參見材料與方法）。使用 RTCA 軟件，減去每時間點緩沖液對照孔的平均基線細胞指數值，從而對數據進行標準化處理（參見詳細文本說明）。因此對照孔細胞指數值為零。誤差列代表監測時間窗內培養孔的標準差。以反應孔的處理細胞的重復多個細胞指數值（兩個重復多個反應板，n=2）均值作圖。誤差列代表重復多個細胞指數值的一個標準差。紅色虛線代表對照孔的3倍標準差。明確導致細胞指數值增加（綠色線）或降低（紅色線）的藥物以實線框加強；無顯著統計學意義的數據（低于3倍標準差-臨界值）以虛線框顯示。
圖 4：原代細胞 GPCR 功能圖。如圖 3 所示，對指定細胞類型的原代細胞進行檢測。
討論
xCELLigence系統的實時無標記細胞檢測技術可加速藥物開發進程，并使基礎研究成果更快的應用至臨床中。我們的研究顯示，通過
xCELLigence 系統，可對腫瘤細胞系與原代細胞的 GPCRs 功能進行檢測。目前研究顯示，一種或更多的細胞系中，檢測的大多數受體靶
GPCR 家族可產生穩定反應，反應強度高于對照孔細胞均值的三倍標準差。以同樣方式對多種細胞類型進行檢測，除本文列出外，還可發現更多的內源性
GPCR檢測數量。已檢測的部分配體可激活 GPCR 家族多個成員。通過所選基因表達圖的激動劑與拮抗劑附加實驗，以及單一受體siRNA
敲除檢測，可對xCELLigence系統檢測到的，引發形態學改變的特異性受體亞型進行確認。
結論
? xCELLigence 系統可對廣泛的內源性 GPCRs 功能進行檢測。
? xCELLigence 系統進行的GPCR 檢測，靈敏性與穩定性非常高。
? xCELLigence 系統進行的GPCR 檢測GPCR 檢測，可用于癌細胞系與原代培養細胞系。
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