近年來，免疫學方法與電鏡技術相結合，形成了一種免疫電鏡技術(Immunoelec-tronmicroscopy，IEM)，使抗原定位達到了亞細胞水平。該技術由以下環節組成：
(一) 組織準備 用于免疫電鏡檢測的組織多種多樣，所以各自在組織制備時都具有其特點。一般講，組織力新鮮并進行無活動力狀態處理，例如樹膠包埋等，避開高溫(55-56℃)，所用溶液都應是中性緩沖液。
1.固定 常用的固定液有甲醛和戊二醛。使用時要注意固定試劑pH值，滲透壓應調整到“生理”狀態。另外四氧化鋨也是一種良好的表面膜穩定劑。
2.固定后處理 組織塊長時間浸于脫水溶劑、液相樹脂中時會抽走分子較小的可溶性抗原，另外超薄樹脂包埋切片長時間與免疫試劑使用(如24-48h)會引起形態學的改變，而采用冰凍切片在很大程度上彌補了這一缺點。近年來，有人在后處理時對組織進行急凍，然后真空抽干，再用鋨蒸氣固定后，可用阿朱伯樹脂包埋。
(二) 切片制備
1.冰凍超薄切片是免疫電鏡技術中應用最廣泛的。先將細胞或組織輕微固定后，用2.3mol/L蔗糖浸潤后速凍，然后進行切片。辣根過氧化物酶標記，或膠體金、鐵蛋白、萄聚糖鐵標記的抗體均可用于該方法的免疫染色。
2.包埋前處理技術 這一方法作為首選用于細胞表面抗原及受體的定位，亦可用于檢測那些易被脫水劑及樹脂成分變性的抗原。首先用于切片刀將新鮮或固定的組織切成20至100微米厚，然后用改良的間接免疫酶技術進行染色，在試劑中加入曲通X-100增加其穿透性，用四氧化鋨后固定，增加DAB染色反差。最后再包埋制超切片。一般認為，在組織中切面下方2-4μm是染色較理想的定位。
3.包埋后切片技術 包括兩種方法，一是用包埋好的組織切成一般切片，免疫染色后用于光鏡檢查，同時作系列超薄切片染色后用電鏡觀察，將光鏡得到的結果與電鏡觀察結果比較，推斷抗原所在部位，這一方法的缺點是不能在亞細胞水平直接定位。另一種方法將包埋后組織直接進行超薄切片后染色，酶標記與膠體金標記的抗體可用于這一方法。
(三) 標記物選擇
1.辣根過氧化物酶 是最常用的一種標記物，性質穩定，分子量小，易穿透組織，在檔記過程中幾乎不受損。其底物為3,3’-二氨基聯苯胺，可通過鋨化或氧化鉆作用增加其電子刻度。
2.鐵蛋白及葡聚糖鐵顆粒 首先用于免疫電鏡標記的是馬脾臟鐵蛋白。應用雙功試劑(如間位苯二甲基二異氰酸（m-Xylyene diisocynate)可將鐵蛋白偶聯于抗體球蛋白分子上，因鐵蛋白分子量大不易穿透，故常采用冰凍超薄切片技術和包埋前處理切片技術。葡聚糖鐵顆粒用于免疫標記時可采用上述方法。
3.放射性標記 該方法已有人應用，采用內標記法將同位素標記到抗體球蛋白分子上。
4.重金屬 應用不廣泛。用膠體金、水銀、鐵、鈾標記抗體等。鈾離子能非特異性結合在整個抗體分子上。因此需先將抗原與抗體結合，再將抗原與抗體分開，除去抗原成分，即得到未失去免疫活性的鈾標記抗體。膠體金能吸附于免疫球蛋白上，吸附的抗體以30000r/min離心沉淀，膠體金標記抗體可保存6個月(5℃)不耐凍結。
5.血藍蛋白 無脊椎動物的血藍蛋白形態規則，在電鏡下容易辯認，可從鱟、角螺、文蛤等的血淋巴液中提取，其分子量達900萬，可用ConA、戊二醛將抗體球蛋白分子聯結于血藍蛋白上。
(四) 免疫電鏡技術操作方法 標記抗體染色程序可根據不同需要，進行直接法、間接法、雜交抗體等方法，就象酶標記抗體一樣。下面介紹幾種常見的免疫電鏡操作程式。
1.不需要標記的病毒電鏡凝結試驗 近年來由于電鏡技術的發展，病毒的電鏡凝結已被用作常規的檢驗手段。用于電鏡檢查的病毒懸液需先經適當的提純和濃縮。細胞培養中的病毒經凍融裂解后，差速離心使病毒沉淀，將沉淀的病毒懸于適量生理鹽水中，取一滴病毒懸液和一滴抗血清，混合后4℃過夜，然后再加一滴3% 磷鎢酸負染，滴于被有炭膜的銅網上，吸干，即可作電鏡檢查。可見病毒顆粒凝結成團 并見有抗體分子的暈，病毒顆粒之間保持著一定距離。在最佳透射條件下，還可看到單獨的、近球形的抗體分子，有時在病毒顆粒之間形成橋。檢查時，要注意與自然形成的病毒團塊相區別，必需設未加血清的對照。電鏡凝結試驗可進行病毒的確切鑒定。
2.凍結超薄切片的免疫染色 將組織用甲醛或戊二醛固定，切成0.5mm3大小，置0.6-2.3mol/L蔗糖溶液中滲透，然后速凍（液氮等），超薄切片，展于用炭膜包被后的銅網上，切片面向下置于含0.3%瓊脂和1%明膠的濕盤上，通過滲透作用除去蔗糖，再用含0.0-0.2mol/L甘氨酸的PBS（PBS-g）漂浮銅網，然后在銅網上滴加含2%明膠PBS，放置10min，再按下列步聚進行：
(1) PBS-g液中置10 min后，PBS漂洗；
(2) 采用工作濃度的一抗體血清孵育，稀釋液中常加明膠或白蛋白(0.4 W.V)，孵育的溫度與時間都需要試驗比較得出；
(3) PBS漂洗；
(4) 膠體金標記二抗(工作濃度、作用時間和溫度均需進行測定)作用后，PBS漂洗；
(5) 置于含2%戊二醛水溶液中5min后，水漂洗，晾干后電鏡觀察。注意同時設置陰性、陽性對照。
3.辣根過氧化物酶-抗辣根過氧化物酶（Peroxidaseantiperoxida-se，PAP） 組化法這一方法主要用于包埋前切片技術。首先將組織用含4%甲醛和0.2%戊二醛的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.4）浸泡固定2-4h（4℃），再用2.3mol/L蔗糖溶液滲透6-8h，液氮速凍后放在2.3mol/ L蔗糖溶液中解凍，然后轉移到PBS中。這一速凍和解凍過程中主要是為了不影響超微結構的前提下凍破細胞以便于標記物及免疫試劑的順利穿透。
(1) 用Vibratome將組織切成20-50μm厚的薄片；
(2) 10%正常血清（如山羊或豬血清）作用30-60min，PBS漂洗；
(3) 加第一抗體（如兔血清）作用過夜；
(4) PBS洗，用第二抗體（羊抗兔血清1:10-1:100）作用1h，PBS洗；
(5) 與辣根過養化物酶―兔抗辣根過氧化物酶復合物（PAP）（1:50）作用1.5-2h，PBS洗；
(6) 置于含0.06%DAB、0.01%H2O2的0.05mol/L Tris-HCL pH7.6溶液中10min，然后浸入PBS溶液中終止反應；
(7) 用1%四氧化鋨作用2h，PBS漂洗；
(8) 脫水進行樹脂包埋，制電鏡超薄切片后觀察。
免疫電鏡技術為抗原亞細胞水平定位提供了有力工具，也為病毒病快速診斷提供了一個新方法。近幾年來，有些科技工作者利用不同標記物在電鏡下呈現不同的形態和電子密度的特點，建立了一些雙標記或多標記免疫電鏡技術，可在同一應系統中，同時觀察不同抗原及受體在細胞表面和細胞結構中的定位。
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