動物所等開發出低DNA用量、無擴增的PacBio建庫技術

基因組信息在生命科學研究中具有重要價值。基于三代長讀長的測序組裝越來越廣泛地應用于基因組學研究。其中，PacBio高保真測序技術因高精度的測序質量被認為是三代測序的金標準。然而，PacBio標準建庫方法需要大量DNA輸入，限制了其在小型昆蟲或珍稀樣本中的應用。DNA擴增雖然可以降低樣本輸入量，但會引入擴增偏好和人工嵌合序列等錯誤，影響基因組的完整性以及變異檢測的準確性。因此，亟待開發低DNA用量、無擴增且操作簡單的PacBio建庫方法。

7月5日，中國科學院動物研究所張勇研究組與中國農業科學院深圳農業基因組研究所阮玨研究組，在《自然-通訊》（Nature Communications）上在線發表了題為Low-input PacBio sequencing generates high-quality individual fly genomes and characterizes mutational processes的研究論文。該研究開發了基于Tn5轉座酶的低DNA用量、無擴增、低成本的PacBio建庫技術——LILAP。該團隊利用這一技術實現了兩個單只雄性黑腹果蠅的全基因組測序和高質量組裝，獲得了內共生菌Wolbachia完整基因組。基因組分析發現了兩個突變特性即復雜轉座事件更傾向于發生在non-B DNA序列富集的區域以及基因轉換事件使轉座子同質化。

LILAP利用Tn5轉座酶和發卡結構的PacBio測序接頭組成二聚體轉座復合物，一步實現DNA片段化和測序接頭連接。全部流程在單個試管內進行，最大限度減少了建庫過程中的DNA損失，簡化了建庫流程。此外，測序接頭內可添加條形碼，可用于多樣本混合建庫測序。

進一步，該研究使用黑腹果蠅ISO1品系對該技術進行評估。結果顯示，兩個單只果蠅的讀段測序質量中位數達到36即堿基錯誤率低于0.02%。從頭組裝的基因組N50數值超過6MB，質量分數超過60即堿基錯誤率低于10^-6，保守單拷貝基因組裝覆蓋度大于98%，超過已發表工作中單只果蠅基因組的質量。

此外，科研人員在全基因組組裝結果中發現了內共生微生物Wolbachia pipientis完整基因組。該團隊檢測了Wolbachia基因組內變異情況，發現了3個新突變，為后續研究共生菌和宿主的互作提供了新線索。

LILAP作為三代低DNA輸入量的建庫方法，在不擴增的前提下將PacBio測序DNA投入量降低至100ng，適用于解析小型生物及其內共生體基因組。未來，LILAP可應用于DNA用量受限的小型生物多樣性研究及較大物種的體細胞變異分析、果蠅個體水平的全基因組關聯分析以及宿主-共生體的協同進化研究。

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