大腦發育過程中神經干細胞不對稱細胞分裂的機制

　　人類大腦發育是一個復雜但是在時空上非常有序的精確組裝過程。神經生物學家們近百年來一直致力于弄清楚體內調控大腦及神經系統發育的細胞分子機制。目前已經發現神經干細胞的不對稱細胞分裂（Asymmetric cell division，ACD）是大腦發育過程中神經干細胞增殖和分化的重要方式。神經干細胞通過ACD，一個母細胞分裂形成兩個不同的子細胞，其中一個子細胞繼承母細胞的干細胞特性，將在發育過程中繼續不斷分裂產生新細胞，而另一個子細胞則將分化成特異神經元，不再具備增殖活性。動物神經系統發育和完善正是通過此過程來一方面不斷生成新的神經元，同時保持體內一定數量的神經干細胞，從而達到增殖和分化平衡。

　　最早期研究發現多細胞生物體中存在一類高度保守的細胞皮質極性蛋白（Par-3以及相關蛋白復合物）。Par-3極性蛋白復合物與Notch蛋白信號通路共同被發現一起在線蟲和果蠅細胞的不對稱分裂過程中起到關鍵決定作用（Guo and Kemphues, 1996； Jan and Jan 2001）。近期相關研究表明脊椎動物神經系統發育過程中一類主要的神經干細胞，radial glia progenitor cells（RGPs），的ACD體內調控很有可能是通過與非脊椎動物體內類似的信號通路完成。但是囿于脊椎動物胚胎發育中神經干細胞的高度多維調控及高分化特性，此外受制于對動物胚胎大腦進行高分辨率活體成像手段的匱乏，我們對于神經干細胞ACD過程中的具體信號調控機制一直并不清楚，很多推論和疑問也亟待證明。其中的一個核心問題是：存在于細胞皮質上的極性蛋白 （e.g., Par-3）是如何來調控細胞質及細胞核內大分子的不對稱分布？

　　2021年6月11日，加州大學舊金山分校Su Guo教授研究組在Science Advances發文題為Polarized endosome dynamics engage cytoplasmic Par-3 that recruits dynein during asymmetric cell division（第一作者為 Xiang Zhao 博士）。該研究利用改進后的熒光抗體活體顯微注射，成功地在斑馬魚胚胎前腦腦室實現了RGP 細胞Notch受體結合蛋白-DeltaD的活體染色標記。結合利用高分辨率快速掃描共聚焦顯微鏡，同時對特異熒光標記的DeltaD在神經干細胞ACD中的胞內動態分布特征進行了觀測統計。該研究發現通過內吞作用進入RGP細胞endosome 的DeltaD蛋白在ACD過程中逐步被運輸到具備增殖活性的子細胞。同時發現該子細胞往往是在斑馬魚前腦內頂端層水平分裂的RGP細胞產生的兩個子細胞中處于尾向端的那一個，分裂完成后它會向基底層迅速遷移。該結果證實了之前在小鼠體內實驗的推論，證明了脊椎動物前腦神經干細胞ACD的保守性。

　　同時該研究通過早期多細胞胚胎期顯微注射，在對DletaD 進行標記的同時，也實現了對腦內單個RGP細胞進行Par-3-GFP體內熒光標記和同步觀測。該工作首次展示了Par-3蛋白和DletaD在RGP細胞分裂過程共同被富集分配到具備干細胞增殖活性的尾向端子細胞的特性。當抑制胚胎體內Par-3表達后，RGP細胞的不對稱分裂被顯著降低，同時DeltaD 在分裂細胞內不再是定向轉運，而更趨向于隨機分布。該研究證實了Par-3能直接調控神經干細胞ACD過程中 Notch信號分子轉運， 更進一步確定了Par-3蛋白對神經干細胞ACD子細胞的命運決定作用。

　　圖1. A. anti-DeltaD (Dld) 熒光標記抗體注射示意圖及在28小時斑馬魚胚胎前腦標記效果。B. 高分辨率共聚焦顯微鏡實時成像顯示RGP細胞分裂全過程中胞內體內Dld特征實時動態。C. RGP細胞ACD全過程中胞內體內Dld時段性特征示意圖。

　　該研究還進一步發現細胞動力蛋白同時也直接參與調控RGP分裂過程中的DeltaD定向運輸。當利用藥物抑制劑抑制細胞動力蛋白活性或者敲底細胞動力蛋白中間體的表達后，RGP細胞內的DeltaD的特征定向轉運同步被抑制。結合組織免疫熒光染色和免疫共沉淀反應，該工作發現Par-3，DeltaD和Dlic1（動力蛋白中間輕鏈）在有絲分裂中晚期，呈現細胞質內共表達和結合特征。最為矚目的是，該工作成功地在斑馬魚胚胎組織冷凍切片上實現了改進后的擴張顯微鏡技術（Label-Retention Expansion Microscopy），利用該技術將切片上的腦組織成功擴展了超過60倍體積，并實現了高靈敏度免疫熒光分子染色和高分辨率共聚焦顯微鏡掃描，最終圖片成像分辨率達到了20納米。通過該方法，在擴展后的RGP胞內成功觀測到清晰的Par-3，Dlic1和DeltaD在轉運過程中的胞內體上的三維分布結構。由此進一步闡釋證實了Par-3通過與胞內動力蛋白結合對 Notch信號分子轉運實現調控的機制。

　　圖. A. 通過擴張顯微鏡技術（Label-Retention Expansion Microscopy）實現60倍擴張后的RGP細胞在高分辨率下呈現的胞內體上的Par-3，Dlic1和DeltaD三維分布。B. Par-3，Dlic1在RGP細胞內共同調控Notch信號胞內體運輸機制示意圖。

　　該工作首次描述并證實了細胞極性蛋白Par-3在RGP有絲分裂過程中存在于細胞質中，并直接調控細胞ACD信號的全部過程以及媒介，并進一步證實了脊椎動物之間保守的神經干細胞不對稱分裂調控機制。該研究首次揭示了Par-3極性蛋白在干細胞胞內體轉運過程的重要作用和機制，該研究將幫助我們更進一步了解該類細胞極性蛋白以及相關信號分子在胚胎發育，干細胞再生調控以及癌癥發生中的作用。