諾獎團隊最新論文：利用CRISPR系統，實現活細胞內單分子RNA成像

要了解單細胞中單個 RNA 分子的多種動態行為，就需要實時以高分辨率對其進行可視化。然而，目前還沒有能夠以通用的方式實現對未經修飾的內源性 RNA 進行單分子活細胞成像。

2025年2月18日，諾貝爾化學獎得主、CRISPR 基因編輯技術先驅 Jennifer Doudna 教授團隊在 Nature Biotechnology 期刊發表了題為：Single-molecule live-cell RNA imaging with CRISPR–Csm 的研究論文。

該研究開發了一種基于 CRISPR–Csm 系統的單分子活細胞熒光原位雜交（smLiveFISH）技術，能夠直接且高效地在可視化各種細胞類型中的任何未經修飾的單個 RNA 分子。利用 smLiveFISH 技術，研究團隊在活細胞中追蹤單個天然 NOTCH2 和 MAP1B 的 mRNA 轉錄本，并確定了其 mRNA 的不同的定位機制。

RNA 直接參與蛋白質合成，并在轉錄和轉錄后水平調控基因表達。除了 RNA 序列之外，個體轉錄本的時空分布也控制著這些活動。事實上，RNA、RNA結合蛋白（RBP）和其他細胞機制之間的動態和協調的相互作用發生在特定的亞細胞區域和時間點。

活細胞 RNA 成像方法已開始揭示單個細胞內的 RNA 動態，彰顯了此類研究的重要價值。然而，基于莖環結構（Stem Loop）或適體（Aptamer）的標記方法需要在 RNA 特定區域插入基因序列，或依賴外源表達標記 RNA——這些操作既耗時又可能干擾 RNA 的天然行為。使用分子信標或 CRISPR-Cas 系統實現未修飾內源 RNA 可視化的方法，則受限于單分子分辨率不足（通常僅限于高豐度重復 RNA ）以及內體滯留探針或過表達熒光蛋白融合體產生的嚴重背景噪聲。

盡管現有方法在特定案例中已獲成功，但開發通用型單分子水平活細胞原生 RNA 成像平臺的需求日益迫切。

在這項最新研究中，研究團隊開發了一種單分子活細胞熒光原位雜交（single-molecule live-cell fluorescence in situ hybridization，smLiveFISH）技術，該技術利用來自嗜熱鏈球菌的 RNA 靶向的 III-A 型 CRISPR-Csm 系統以及多重向導 RNA，能夠直接且高效地在包括原代細胞在內的多種細胞類型中對任何未經修飾的單個 RNA 分子進行可視化成像，從而追蹤不同種類活細胞中的單個 mRNA 分子。

smLiveFISH成像天然單個 mRNA 分子的原理

研究團隊利用 smLiveFISH 技術分析了兩種不同 mRNA（NOTCH2 和 MAP1B）的行為，這兩種 mRNA 分別編碼一種細胞表面受體蛋白和一種微管相關蛋白。結果顯示，NOTCH2 的 mRNA 包含兩種具有不同動態特性的群體，這與共翻譯多肽在內質網（ER）中的跨膜轉運有關。相比之下，MAP1B 的 mRNA 表現出幾種不同的行為，包括以不依賴翻譯的方式進行定向運輸。

活細胞中單個 NOTCH2 mRNA 的動態變化

活細胞中單個 MAP1B mRNA 的動態變化

研究團隊進一步證明，smLiveFISH 能夠檢測出單個轉錄本在對小分子作出反應時定位上的差異，例如被整合入 mRNA 處理小體（也叫做 P 小體），這突顯了 smLiveFISH 技術在評估單個內源性 RNA 行為中的實用性。因此，smLiveFISH 技術有可能揭示健康和疾病狀態下天然轉錄本的時空組織原理。