組蛋白（Histone）在真核生物染色體中扮演著重要的角色，是染色體結構單元核小體的重要組成部分。由核心組蛋白H3，H4，H2A，H2B形成的八聚體是DNA纏繞的主要承載體【1】。除了用以裝配染色體外，組蛋白的另外一個重要功能是參與基因組信息的表達調控。組蛋白氨基酸殘基上的翻譯后修飾如乙酰化、甲基化等調控著基因組特定區域的基因表達狀況，最終使得含有相同DNA序列的細胞具有不同的命運【2–4】。
為了研究組蛋白修飾在真核生物中的功能，戴俊彪研究員早在2008年報道了組蛋白系統突變庫的研究策略，通過將酵母基因組中組蛋白基因敲除并回補組蛋白突變體的方式，系統地研究了組蛋白H3和H4上每一個氨基酸位點被突變成丙氨酸之后對酵母造成的影響【5】，最近又完成了對組蛋白H2A和H2B的系統性突變研究【6,7】。然而酵母是單細胞真核生物，對于研究組蛋白在生物體發育過程中的功能存在先天局限。絕大部分多細胞真核生物由于組蛋白基因分散，基因打靶難度大等限制因素，至今尚無系統突變庫研究報道。
2018年12月27日，上海科技大學高冠軍課題組和中科院深圳先進技術研究院戴俊彪課題組合作在Developmental Cell在線發表了題為Probing the Function of Metazoan Histones with a Systematic Library of H3 and H4 Mutants的研究論文，研究者首先建立了果蠅組蛋白H3/H4系統突變庫，并利用系統突變庫解析了組蛋白劑量以及修飾在果蠅發育過程中的多重功能。
為了實現果蠅中野生型核心組蛋白基因的全敲除，研究人員利用CRISPR/Cas9技術分別在組蛋白基因列陣上下游各插入FRT（flippase recognition target）位點，利用重組酶flippase的作用實現基因組大片段刪除，從而獲得一條染色體上組蛋白基因全部刪除的突變體，再通過雜交的方式可以獲得組蛋白基因全敲除突變體。然而由于組蛋白對于胚胎的發育不可或缺，組蛋白基因全敲除突變體僅能夠依靠母源組蛋白和組蛋白mRNA完成胚胎發育的前14個細胞周期【8】。研究人員進而在組蛋白敲除雜合突變體中利用phiC31整合酶系統在組蛋白基因列陣原位上回補了人工設計后的野生型組蛋白基因單元。研究人員發現，低劑量的組蛋白基因單元分別對果蠅精巢和卵巢造成不同程度的影響，而最終回補20個拷貝的組蛋白基因單元可以獲得與野生型果蠅相類似的表型（圖1）。
圖1. 組蛋白基因劑量不足影響果蠅精巢和卵巢的發育
為了研究組蛋白修飾的功能，研究人員對組蛋白H3和H4上已報道被修飾的氨基酸位點逐一進行了丙氨酸的突變，利用獨立開發的大片段重復序列分級組裝策略，系統性構建了40個含有不同組蛋白突變的果蠅突變體模型（圖2）。
圖2. 組蛋白突變體分級組裝策略示意圖
研究者對這些果蠅突變體研究發現，接近50%的突變體無法發育成成體，表現出與單細胞酵母間巨大的差異性。通過基于平衡染色體上的熒光追蹤，研究者將這些致死突變體根據致死時期分別劃分為胚胎期、幼蟲期以及蛹期致死突變體。隨后研究者從果蠅育性、DNA損傷敏感性以及基因沉默等多方面入手，對突變庫進行高通量測試，發現利用該H3/H4組蛋白突變庫進行不同生物學問題的研究時，不僅可以得到與前人研究一致的研究結論，還能突破現有的研究局限，獲得更深層次的認知。研究者以H4K16A突變體為例，發現乙酰轉移酶MOF（males-absent on the first）對于雌性果蠅存活率以及壽命的調控并非通過H4K16位點乙酰化實現的，通過對卵巢中生殖干細胞數量的追蹤發現，H4K16位點的修飾對于雌性果蠅生殖干細胞的維持是必需的。研究者還發現雄性H4K16A突變體存活率僅有10%左右，推測原因是在雄性H4K16A突變體中更多的X染色體連鎖基因以及常染色體基因表達發生了下調。
由于胚胎期致死組蛋白突變體無法獲取實驗材料，例如純合H3K27A胚胎在發育10小時左右停止細胞分裂（圖3A），極大地限制了對這一類突變體的研究。為此，研究者單獨開發了一套組織條件性敲除系統，能夠在既含有野生型也含有突變型組蛋白基因的成體果蠅中，簡單快速地敲除一部分體細胞中的野生型組蛋白基因，從而在成體果蠅中研究某一特定組蛋白突變對基因表達調控的影響。以多梳（Polycomb）蛋白調控為例，研究者利用組織條件性敲除系統，鑒定到H3R26A突變體通過影響H3K27三甲基化實現對Hox基因解抑制作用。
圖3. H3R26A突變體通過影響H3K27me3實現對Hox基因解抑制作用
該研究利用CRISPR/Cas9系統對果蠅組蛋白基因列陣進行全敲除編輯，首次實現在基因組中組蛋白原位進行回補，排除了基因位置效應影響，并且在構建組蛋白突變體通量上實現巨大突破，為國際同行提供了新穎的研究思路和寶貴的研究資源。
1.Luger, K., M?der, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F. & Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 ? resolution. Nature 389, 251–260 (1997).
2.Kouzarides, T. Chromatin Modifications and Their Function. Cell 128, 693–705 (2007).
3.Tan, M. et al. Identification of 67 histone marks and histone lysine crotonylation as a new type of histone modification. Cell 146, 1016–1028 (2011).
4.Goldberg, A. D., Allis, C. D. & Bernstein, E. Epigenetics: a landscape takes shape. Cell 128, 635–638 (2007).
5.Dai, J. et al. Probing Nucleosome Function: A Highly Versatile Library of Synthetic Histone H3 and H4 Mutants. Cell 134, 1066–1078 (2008).
6. Jiang, S. et al. Dissecting Nucleosome Function with a Comprehensive Histone H2A and H2B Mutant Library. G3 (Bethesda) 7:3857-3866 (2017).
7. Jiang, S. et al. Construction of Comprehensive Dosage-Matching Core Histone Mutant Libraries for Saccharomyces cerevisiae. Genetics 207:1263-1273 (2017).
8.Günesdogan, U., J?ckle, H. & Herzig, A. Histone supply regulates S phase timing and cell cycle progression. Elife 3, e02443 (2014).